第十一章_无机基质高效色谱填料

第十一章无机基质高效色谱填料微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆实心微球全孔微球灌注微粒固定相外壳固体核扩散孔通孔HPLC中常用的几种微粒类型①硅胶②可控孔径玻璃③其它：氧化铝、氧化锆、氧化钛、碳和石墨微球。•制备:制成适宜的球形或无定形颗粒,化学键合或涂层法改性。第一节无机基质一.硅胶:①表面含丰富硅醇基或硅羟基,可化学键合或改性;②表面存在大量物理吸附水,增加处理或修饰复杂性。1.化学性质:多孔二氧化硅•化学性质稳定,pH适应范围1-9，安全pH范围为2-8。晶型二氧化硅表面可能仅有自由硅羟基；无定形硅胶则有自由硅羟基、邻位硅羟基、氢键结合水或物理吸附水。SiOH自由硅羟基双硅羟基OHSi缔合硅羟基OHSi表面金属内部金属（活化硅羟基）OHSiOHSiOHMMHPLC硅胶担体的表面•物理吸附水的去除---是硅胶衍生反应中不可或缺的一步。因为物理吸附水与硅羟基竞争硅烷化试剂的反应,可能引起键合率的降低和非特异性吸附的增加,降低填料的性能。•一般通过加热或真空下热处理去除物理吸附水。2.物理性质:颗粒的形状大小、孔的结构、孔径及其分布、总孔容、比表面积、高机械强度20468101214161820222426保留时间（min）1234123检测器响应A型硅胶Zorbax-ODS二甲基-C18B型硅胶ZorbaxRx-C18二甲基-C181、多虑平0.125ug2、去甲丙咪嗪0.25ug3、阿米替林0.25ug4、三甲丙咪嗪0.25ug以A型与B型硅胶担体的色谱柱分离三环抗抑郁药的比较色谱柱：15×0.46cm；流动相：乙腈-0.025M磷酸钠缓冲液（30：70），pH2.5+三乙胺与三氟醋酸各0.2%；流速：1.0ml/min；400C；254nm检测；进样5μL。A型：纯度不高的酸性硅胶B型：高纯度的弱酸性硅胶3.多孔硅胶的制法:①将水玻璃(硅酸钠水溶液)酸化,形成SiO2胶体溶液,以各种方法聚集成球形粒子,并转化成干胶;②另外,也可利用正硅酸酯的缩聚和SiO2气溶胶水溶液喷雾干燥法。•粒度分布及杂质的控制是难点！堆砌硅珠法•尿素、甲醛相分离聚合：将适宜浓度的硅溶胶与一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，搅拌均匀令其产生缩聚反应。待反应进行到一定程度后，便会产生相分离而从水溶液中沉淀出聚集硅微珠与尿素－甲醛树脂的复合球。将这种复合球收集、洗涤并在高温炉中煅烧，令树脂分解逸去，剩下的就是多孔硅胶微球，其直径可以控制在4－5µm或7－8µm之间。通过二次缩聚反应，直径可加大到15µm。二.可控孔径玻璃:•含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃,热处理时会相分离，生成溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶于酸的高硅相。以酸处理的方法，将酸可溶相浸析出来,剩下的高硅相就成了可控玻璃(SiO2)。•控制玻璃的组成及处理条件可控制生成可控孔径玻璃的孔径、孔容及比表面积。1.化学性质:•表面具有游离硅羟基,可以通过各种化学修饰而得到不同官能团的表面。•缺点：游离硅羟基可能导致非特异性吸附及蛋白质失活;适应的pH范围有一定的局限;制造成本较高。2.物理特性:•机械强度高,可耐受剧烈、反复的处理和操作，耐压力强。•孔径分布窄而均匀。3.制造:•采用普通玻璃制造工艺：精细选择并控制适宜的相分离温度与时间。孔径一般控制在25nm到100nm为宜。三、其它氧化铝：主要是γ－Al2O3,作为色谱固定相，主要用于小分子有机物等的分离。限制其应用的因素在于其难以像SiO2那样通过键合而得到适应不同分离模式的固定相。氧化锆：利用与硅胶键合相类似的方法，可以对其进行表面修饰。第二节硅胶的化学修饰与改性一、表面硅羟基的化学修饰（主要途径）：1、氯化反应：可以将硅羟基转化成硅氯基，硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引入相应的基团。这种方法引入的基团是单分子层的，具有较好的传质能力和色谱性能，但成本较高。2、氯硅烷与硅羟基的反应：•通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅胶表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。3、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：•烷氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础上可以很方便地进一步进行反应或修饰。这一键合反应可以在水相，也可以在有机介质中进行。Si-OHCl-Si(CH3)2RCl3SiR(Eto)3SiRa+cSi-O-Si(CH3)2RbSi-OHSi-OHSi-OHSi-OHSi-OSi-OSi-OSi-O++SiClRSi(OEt)R（a）表面硅羟基与氯二甲基硅烷的反应；（b）表面硅羟基与三官能团硅烷的反应；（c）表面硅羟基与三官能团烷基硅烷的反应A、纵向交联B、横向交联C、单体（二甲基-取代）D、单体（空间保护）SiOOHSiSiSiSiSiOOHOSiOSiOHSiOHOSiSiOHOOHOHSiOSiSiSiSiSiOOSiOOOOOOOOOOSiSiSiSiSiSiSiSiOSiSiSiSiSiOHOOSiOHSiSiOHSiSiSiSiOHOSiSiSiOSiOH与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型二、包敷与涂层：1.可通过不同的途径制备稳定的聚合物涂层。常将选择的聚合物、寡聚物或单体以适宜溶剂制成溶液，均匀分布于无机基质的全部表面上，蒸去溶剂后，令高聚物或单体聚合，形成致密的聚合物涂层。2.亦可将含双键的聚合物涂于硅胶表面，使其表面带上双键，使其于随后涂敷上去的第二单体进行共聚。3.还可以将含有双键的不饱和聚合物涂于硅胶表面，以自由基引发进一步交联，以获得理化性质更稳定的涂层。三、整体修饰：•指利用具有不同官能团的卤代硅烷或烷氧基硅烷的水解、缩聚反应，直接制出空间交联型、含不同R基的硅胶。四、硅烷化试剂：•氯硅烷：容易和空气中微量水反应，放出HCl气，对环境造成危害。•烷氧基硅烷：对环境和人体的危害性小。广泛应用。各类无机色谱填料•正相色谱填料•反相色谱填料•凝胶过滤色谱填料•高效离子交换色谱填料•高效亲和色谱填料•高效疏水色谱填料第三节正相色谱填料•液相色谱分正相和反相色谱（依据相间的相对极性）正相：固定相极性大于流动相极性，适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离，如脂溶性维生素、甾体激素、医药等的分离分析。反相：固定相极性小于流动相极性。•正相色谱≈液固吸附色谱柱填料：吸附剂，表面分布有活性吸附位点；竞争吸附：溶剂－溶质分子，溶质－溶质分子柱内保留时间差异物质分离！1.硅胶吸附色谱中最常用。但样品呈碱性时，会造成严重吸附，溶质峰拖尾或难以洗脱，可选用Al2O3。Al2O3对于不饱和化合物，特别是芳香族化合物多核芳烃的保留能力较强，芳香异构体可得到良好分离。•硅胶100-200目•2.5KG•生产商:Fisher•产品价格:4500元（RMB）化学键合固定相：将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。2.极性键合相填料键合固定相类型：用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子可成键,即可得到各种性能的固定相。一般分3类：（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基。（2）极性基团如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基、季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。键合固定相成键类型a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N键合固定相的制备（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相,最先用于液相色谱。用醇与硅醇基发生酯化反应：≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20这类键合固定相的有机表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。共价键键合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在4～8范围内。OHSiSOCl2ClSi+HgBrSiSiNHCH2CHNH2H2NCH2CH2NH2（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相制备反应如下：（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相制备反应如下：OHSiClSiR3+SiO(ROSiR3)SiR3+HCl这类键合固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，PH=2～8范围内正常工作，应用较广泛。第四节反相填料及色谱柱•非极性固定相，极性流动相•在色谱的应用中，反相模式占57％。反相色谱填料的种类与性质•品种繁多，性质各异。•市场主流：无机材料为基质制备的填料•在硅胶基质的填料中，以键合有C18、C8、C4及C3的球形、全多孔填料最常见。•参见P239：表11－6；P242－244：表11－7。第五节－第八节其它色谱类型填料自学！请注意掌握几个要点：①色谱的分离原理②色谱填料的种类与性能③色谱填料的制备④常见的色谱填料第九节生化分离用色谱填料的新进展未来液相色谱的特点：两极分化式发展适应制备色谱需要：高效、高选择性、高速、低成本液相色谱适应分析色谱需要：高效、高选择性、高通量、快速主要体现：①提高柱效②提高选择性③提高化学稳定性④提高分离速度⑤提高生物相容性⑥提高性能重现性⑦提高性能价格比具体地：•细粒径填料：粒径减小，理论塔板数增加，但柱子渗透性降低，操作压力升高。若缩短柱长可适当缓解，但单柱柱效不明显。•降低硅胶填料的非特异性吸附：长期问题－对碱性溶质非特异性吸附，乃因硅胶中的杂质金属离子及键合时在硅胶表面引起的硅羟基。•贯流色谱：既有通常的微孔或大孔，又有贯穿整个颗粒的超大孔。同时具高流速、高效率、高样品负载量和低操作压力的特点。•整体柱：即连续固定相，用原位聚合和类似浇铸的方法，形成整体、连续的柱体，不需用细粒径的填料填装。放大1300倍的君影草放大10倍的拟南芥根部BellcoGlass生物反应器放大13倍的结晶混合物放大100倍的专业纸纤维放大200倍的链孢霉晶体森林人体免疫系统抵御病菌鱿鱼吸管Thankyou!