蛋白质氨基酸糖的鉴别试验及其比较

蛋白质1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。2.双缩脲反应biuretreaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。在540nm波长处有最大吸收。可用于蛋白质的定性和定量检测。紫色络合物分子结构式在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。双缩脲反应的鉴定由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。配制双缩脲试剂的注意事项双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！蛋白质检测方法比较氨基酸茚三酮鉴别试验的反应方程式：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2%费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间双缩脲法灵敏度低，1-20mg中速20-30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似紫外吸收光法较为灵敏，50-100微克快速5-10分钟蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外光吸收各种嘌呤和各种核苷酸用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法灵敏度最高，1-5微克快速5-15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色其λmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液，TritonX-100SDS最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化Folin酚试剂法灵敏度高，5微克慢速40-60分钟双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化CCCOOOCCCOOOHOHH2OH2OCO2NH2RCHO++++CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2++CCCOOOCCCOOHHO氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸为黄色化合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。糖分的鉴别实验1.Fehling试验生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。CuSO4+2NaOH=====Cu（OH）2+Na2SO42CH3(CH2OH)4CHO+2Cu(OH)2---（加热）--→2CH3(CH2OH)4COOH+Cu2O(砖红色沉淀)+2H2O2.Molish试验生药水浸液，加a-萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在二液面交界处出现紫红色环。OH2H2SO4浓羟甲基糠醛HOH2COCHOHOH2CCSO3HHO3SOHOOOHH2SO4浓糖紫红色复合物3.成脎试验生药的水浸液与盐酸苯肼液共热，只要有糖类成分存在，即生成黄色的糖脎结晶。镜检结晶，可视结晶的形状而鉴定出糖的种类。4.层析法取生药浸出液（多糖类需水解），以某种糖为对照品一起进行层析检测。常用纸层析法，正丁醇-乙酸-水（4:1:5上层）作展开剂，新配制的氨化硝酸银溶液为显色剂，结果还原糖形成黑色斑点。糖检测方法比较方法原理试剂操作说明Molish反应——α-萘酚反应糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在Molish试剂：取5gα-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。取试管，编号，分别加入各待测糖溶液1mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。单糖、双糖、多糖一般都发生此反应，但氨基糖不发生此反应。丙酮、甲酸、乳酸、草酸、葡萄糖醛酸、各种醛糖衍生物、甘油醛等均产生近似的颜色反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。蒽酮反应糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。蒽酮试剂：取0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸中，当日取试管，编号，均加入1ml蒽酮溶液，再向各管滴加2~3滴待测该方法可以用于测定几乎所有碳水化合物的含量，包括戊糖、己糖，多糖该复合物在630nm有最大的吸收峰，并且在一定范围内，颜色与糖量的多少成正比配制。待测糖溶液，同Molish试验。糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。等。酮糖的Seliwanoff反应酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。Sediwanoff试剂：0.5g间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。取试管，编号，各加入Sediwanoff试剂1mL，再依次分别加入待测糖溶液各4滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。Fehling试验费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。由于沉淀的速度不同，而形成的颗粒大小也不同，颗粒大的为红色，颗粒小的为黄色。试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。试剂乙：称取125gNaOH137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。取试管，编号，各加入Fehlin试剂甲和乙1mL。摇匀后，分别加入4滴待测糖溶液，置沸水浴中加热2~3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。Benedict试验（本尼迪特试验）Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。取试管，编号，分别加入2mLBenedict试剂和4滴待测糖溶液，沸水浴中加热5分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。Barfoed试验（巴弗德氏试剂）在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。取试管，编号，分别加入2mLBarfoed试剂和2~3滴待测糖溶液，煮沸2-3分钟，放置20分钟以上，比较各管的颜色变化。还原二糖：麦芽糖、乳糖、纤维二糖