第十一章高效液相色谱法.

1第十一章高效液相色谱法Chapter11.highperformanceliquidchromatography；HPLC211.1高效液相色谱法定义及特点11.2高效液相色谱与气相色谱的区别11.3高效液相色谱分类及分离原理11.4高效液相色谱主要组成部件11.5高效液相色谱在环境应用11.6高效液相色谱分析方法的建立11.7高效液相色谱保养与维护11.8高效液相色谱定性与定量分析11.1高效液相色谱法定义：液相色谱法是指以流动相为液体的色谱技术。采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，这种新的色谱法叫高效液相色谱法。34高压：液相色谱法以液体为流动相，液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能使其迅速通过色谱柱，须对载液施加高压，150-350*105Pa；高速：采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快。只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数小时；高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；高灵敏度：紫外检测器最小检测量10-9g，荧光检测器灵敏度可达10-11g。应用范围广：约80%的有机物，特别是高沸点、大分子和热稳定性差的有机化合物；高效液相色谱特点5相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测11.2高效液相色谱与气相色谱比较1.分析对象2.流动相3.柱分离4.操作条件主要差别：HPLC与GC异同点气相色谱高效液相色谱分析对象：只限于分析气体和低沸点的稳定化合物，只能分析20%的化合物流动相：采用的有限几种惰性气体，只有运载作用，对组分作用小；无毒，易于处理；操作条件：加温操作，进样口必须高温。分析对象：可以分析高沸点高分子量的稳定或不稳定化合物，这种物质占有机物的80%；流动相：采用流动相为液体，除了运载作用，还与组分作用，因此，它对分离贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离；流动相有毒，费用较高；操作条件：室温、高压。7按固定相分类按分离机理分类液液色谱法LLC液固色谱法LSC分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法化学键合色谱法亲合色谱法胶束色谱法HPLC11.3HPLC的分类与基本原理14.3.1高效液相色谱法的分类8一、液液分配色谱法（LLC）二、液固吸附色谱法（LSC）三、化学键合相色谱法（CBC）四、离子对色谱法五、离子色谱法一、液液分配色谱法基本概念：色谱分离是基于样品组分在固定相和流动相之间分配系数不同而分离的色谱法（LLC），称为液-液分配色谱。特点：流动相和固定相为载体+固定液；流动相和固定相应互不相容，两者之间有一明显的分界面。分离机制：由于样品组分溶入固定相(s)与流动相（L）达到“平衡”分配系数K的差别而分离。分配达平衡时，服从分配系数公示K=Cs/CL组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大（K越大），分离效果越好1011正相液液色谱法（NLLC）：固定液极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相液液色谱法（RLLC）：固定液极性流动相极性极性的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。液液分配色谱分类12正相色谱法反相色谱法1.极性固定相聚乙二醇、氨基与腈基键合相2.相对非极性流动相正已烷、环已烷3.极性调节剂乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷4.分离中等极性和极性较强化合物.酚类、胺类、羰基类及氨基酸类5.组分流出顺序极性小先洗出1.非极性固定相C18（简称ODS）、C82.极性流动相水或缓冲液3.极性调节剂甲醇、乙腈4.分离非极性和极性较弱化合物占整个HPLC应用的80%左右5.组分流出顺序极性大先洗出液液分配色谱分类13液固吸附色谱法流动相为液体，固定相为固体吸附剂二、液固吸附色谱14吸附脱附再吸附再脱附…分离过程是一个吸附－脱附的平衡过程。液固吸附色谱分离机理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异作用机制：溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂表面的竞争吸附，对吸附剂表面的活性中心发生吸附竞争。组分分子对活性中心的竞争能力的大小决定了它们保留值的大小。被活性中心吸附越强的组分分子越不容易被流动相洗脱，k值就大；反之k值就小。组分之间的k值相差越大，分离越容易。用下式表示：Xm+nSaXm+nSa15三、化学键合相色谱法（CBC）基本概念：借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱单体（硅胶表面硅胶醇）上而获得的固定相称为化学固定相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法。特点：化学键合色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法；液液色谱发展而来；16化学键合色谱分类17化学键合色谱分离机制反相键合色谱法：分离机理较复杂，目前比较合理解释非极性键合相色谱保留特征的理论是疏溶剂作用理论和双保留机制。正相键合色谱法：正相键合色谱的保留机制既有吸附的因素也有分配的因素。正反相色谱中极性和保留时间的关系18定义：在流动相中加入与被测定离子相反电荷的离子对试剂，使之行成中性的离子对化合物，以分离离子型化合物或可离子化的化合物的方法。分类：正相离子对色谱法（NPIC）和反相离子对色谱法（RPIC）正相离子对色谱法（NPIC）很少使用，故只讨论反相离子对色谱法。19四、离子对色谱法20离子对色谱机理21离子对色谱机理固定相：非极性键合相（C8和C18）流动相：甲醇（乙腈）-水+离子对试剂22离子对色谱固定相和流动相23五、离子交换色谱法基本概念：是基于离子交换树脂可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换。根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的色谱分析法。分离机制：组分在固定相发生的反复离子交换反应，组分与离子交换剂之间亲和力不同而被分离；24固定相：阳离子交换树脂：强酸性和弱酸性阴离子交换树脂：强碱性和弱碱性25流动相：应用：26离子交换色谱法油田水质中的阴离子分析固定相：薄壳型阴离子交换树脂(3×250mm)流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3六、离子色谱法详见十二章27HPLC的仪器组成色谱泵自动进样器色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统流动相11.5高效液相色谱的流程及主要部件28HPLC仪器结构图注射器进样器高压泵混合室溶剂预柱接头色谱柱检测器数据系统29一、主要部件1.高压输液泵2.进样器3.色谱柱4.检测器5.数据记录和处理系统此外，根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度淋洗装置、自动进样系统、柱后反应系统等30液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器AEGBCDF进样阀泵输液分离检测记录进样311．高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪的是核心部件。(a)功能:驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统(b)特性：应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀。(c)分类:常用的输液泵分为恒流泵（常用）和恒压泵两种。322.梯度淋洗装置梯度淋洗装置：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）梯度洗脱的实质：是通过不断地变化流动相的浓度配比，来调整混合样品中各组分的K值，使所有谱带都以最佳平均K值通过色谱柱。梯度洗脱与程序升温：在梯度洗脱中溶质K值的变化是通过溶剂的极性、pH值和离子强度来实现的，用于分离组分性质差别较大的复杂样品；而程序升温是借改变温度来影响溶质的K值，用于分离宽沸程的混合样品。33分类：根据溶剂混合时所受的压力分为两种类型低压梯度（外梯度）高压梯度（内梯度）梯度洗脱的实现依赖于泵系统34外梯度:不同极性的溶剂在常压下按一定的比例混合，利用1台高压输液泵至入色谱柱。常压下先混合后进泵，故称为外梯度（低压梯度）内梯度:2台高压泵,每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。35手动进样363．进样系统37自动进样器进样自动进样的样品量可连续调节，进样重复性高，适合做大量样品分析。384.分离系统——色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。功能：分离样品中的各个物质一般用直型柱柱长为10～100cm，分析型柱内径2～5mm，制备型内径较大为6～10mm柱效性能评价：H、n、fs、k和α的重复性，或R发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。3940六溴环十二烷（hexabromocylcododecane,HBCD）是一种用于建筑业，纺织业和电子产业的溴代阻燃剂HBCD有多个手性中心，六种立体异构体，但在化工产品中α，β，γ-HBCD.β环糊精手性柱氨基醇类药物：替考拉宁手性柱415．检测系统（1）检测器(detector)的主要性能要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）噪音（noise）低线性范围（linearrange）宽重复性（repeatability）好适用范围广（通用型、专属型）（2）主要分类紫外光度检测器：适用吸收紫外光的吸收荧光检测器：只能分析自身发光的物质，灵敏度高；示差折光检测器：利用折光率的差别42紫外检测器(ultraviolet-visibledetector，UVD)检测原理：基于被分析样品组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律。响应信号（吸光度）与浓度成正比A=㏑I0/I=εbcI0为入射光强度；I为透射光强度；ε摩尔吸光系数，b为检测器光程长度；c为组分摩尔浓度43应用使用范围广，有π键和孤对电子的物质，如烯烃、芳烃以及含有C=O、C=S、N=O、N=N基团的化合物。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。44荧光检测器（fluorescencedetector）在紫外光的激发下能发荧光的化合物或能用衍生法制成荧光衍生物的物质均可进行荧光检测。特点：高灵敏度比紫外检测器检测限高10-10g/ml高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；激发波长(ex)和发射波长(em)的选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长：280、333和365nm；发射波长350、390和410nm45在食品研究中的分析应用食品中的天然成分碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素〕维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素〕农药和兽药残留多环芳烃（PAHs〕和亚硝酸11.6高效液相色谱的应用46在兽药研究中分析应用在医药研究中分析应用常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。11.6高效液相色谱的应用47在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析11.6高效液相色谱的应用48化学结构极性和稳定程度水中和有机溶剂中溶解度相对分子质量的大小熟悉各种色谱类型主要特点应用范围一、