血涂片的制备

实验二血涂片的制备PreparationofBloodSmear实验原理使用推片将血液在载玻片制成血膜。试剂器材载玻片（清洁、干燥、无尘、无油脂、25cm×75cm，厚度0.8mm~1.2mm）、推片。操作步骤（1）采血静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴（约0.05ml）抗凝血，如果使用手指采血则直接用洁净玻片蘸1滴血。（2）推片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈30。~45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片（图1-6），血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。（3）干燥将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。（4）标记在载玻片的一端用记号笔编号。注意事项1．要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约1mol/LHCl浸泡24h后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20min，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馏水最后浸洗后擦干备用。边缘破碎、玻面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。2．最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。制片前标本不宜冷藏。涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。故针对不同病人应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的病人应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。3．血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此画线应注意保存血涂片尾部细胞。4．血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。实验评价血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可图1-6推片获得满意的血涂片外，抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，可提高阳性检出率。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）采用厚血涂片法。随着当今的自动化的发展，出现了自动血液涂片和染色装置。自动的血液涂抹装置主要有两类，一类是离心法，可以将少量细胞浓缩涂片；另一类是机械涂片法，其模拟手工涂片，适用于大量血涂片的制备。一般来说自动血液涂片装置可获得细胞分布均匀、形态完好的血片，但尚未普遍推广。思考题从外观来判断，一张好的血涂片有哪些特征？血涂片的制备与染色血涂片的制备:【器材】清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片(25㎜×75㎜,厚度为0.8～1.2㎜).【操作】血涂片制备方法很多,目前临床实验室采用的是手工推片法,在玻片近一端1cm处.加一滴0.05ml充分混匀的血液,握住另一张边缘光滑的推片,以30°～45°角使血滴沿推片迅速散开,快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端.【附注】1.血片通常分头、体、尾三部分.2.推好的血涂片应在空气中晃动,使其尽快干燥.天气寒冷或潮湿时,应于37℃恒温箱保温促干,以免细胞变形缩小.3.涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞的比容有关.一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚；反之则血膜薄.4.涂片应在1h内染色或在1h内用无水甲醇固定后染色.5.新购置的载玻片常带有游离碱质,必须用浓度约1mol∕LHCL浸泡24h后,再用清水彻底冲洗.血涂片染色:瑞士染色法【原理】瑞士染色法使细胞既有化学亲和反应,有又物理吸附作用.各种细胞由于其化学成分不同,对酸性及碱性染料的结合力也不同,因此,染色后各种细胞呈现出各自的染色特点.【试剂】瑞士染液Ⅰ液:瑞士染料0.1g,甲醇60.0ml瑞士燃料有酸性燃料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成.将瑞士染料放入清洁干燥研钵里,先加少量的甲醇,充分研磨使燃染料溶解,将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中,未溶解的在加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解,甲醇全部用完为止.配好后放入室温下,一周后即可使用.新配染液效果较差,放置时间延长,染色效果越好.久置应密封,以免甲醇挥发或氧化成甲酸.染液中也可加中性甘油2～3ml,除可防止甲醇过早挥发外,也可使细胞着色清晰.Ⅱ液:Ph6.4～6.8磷酸盐缓冲液磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3g磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.2g加蒸馏水加至1000ml.配好后用磷酸盐溶液校正PH,塞进瓶口贮存.如无缓冲液可用蒸馏水代替.【附注】1.pH对细胞染色有影响.2.未干透的血膜不能染色.否则染色时血膜易脱落.3.染色时间与染色浓度、染色时温度成反比;而与细胞数量成正比.4.冲洗不能先倒掉染液,应用流水冲去,以防染料沉淀在血膜上.5.如血膜上有染料颗粒沉积,可加少许甲醇溶解.【操作】1.采血后推制厚薄适宜的血涂片.2.用蜡笔在血膜两边划线,然后将血膜放在染色架上.3.瑞士染液数滴,以覆盖整个血膜为宜,定血膜约1min.4.滴加约等量的缓冲液与染液混合,室温下染色5～10min.5.用流水冲去染液待干燥后镜检.步骤：采血，推片，干燥，标记，染色1.采血准备工作：按摩，消毒，针刺，吸血，止血2.推片:一张良好血涂片的要求：厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，边缘整齐，两端和两边留有空隙血涂片制备的注意事项：血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快，则血膜愈厚；反之，血涂片愈薄。针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者宜采用小血滴、小角度、慢推；贫血患者则相反。引起血涂片分布不均的主要原因：推片边缘不整齐（毛刷状）用力不均匀（阶梯状）载片不清洁（有空泡）3.干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小4.标记5.染色：瑞氏染色法(Wright’sstain)1.染液成分：①美蓝（亚甲蓝）：M＋碱性染料②伊红（曙红）：E－酸性染料③瑞氏染料：M＋＋E-ME↓（伊－美中性物）④甲醇：溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触2.染色原理：①基本原理：物理吸附、化学亲和作用②碱性物质（Hb、嗜酸性颗粒）――嗜酸性物质、染成粉红色（E－）③酸性物质（核蛋白、RNA）――嗜碱性物质、染成蓝或紫蓝色（M＋）④中性颗粒（中性细胞胞浆）――嗜中性物质、染成淡紫红色（M＋E－）pH的影响：H＋（pHPI）：蛋白质与碱性染料（M+）亲和力下降，增强伊红着色，出现红染OH－（pHPI）：蛋白质与酸性染料（E-）亲和力下降，增强美蓝着色，出现蓝染PBS缓冲液：pH:6.4－6.8以维持恒定的pH环境3.染色方法①固定：滴加染液3~5滴，覆盖整个血膜固定细胞0.5－1min②染色：加1~2倍PBS缓冲液，混匀染5~10min③冲洗：平衡摇动，于自来水龙头上平置冲洗（从一端开始），或加PBS缓冲液冲洗4.染色结果①外观：淡紫红色②镜下：红细胞――粉红色碟状白细胞――胞核、胞浆及颗粒显示特有的染色特征5.红细胞与中性粒细胞红细胞:淡红色圆盘状，中央有生理性淡染区。中性粒细胞：细胞核染深紫红色，细胞质呈粉红色，含有许多细小的淡粉红色颗粒，淋巴细胞：细胞核染深紫红色，胞质少，仅在核的一侧见到少量淡蓝色胞质注意事项：①血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落；②染色时间与染液浓度、室温及有核细胞多少有关，一般染液淡、室温低，有核细胞多，染色时间长。③染液不能过少，以防蒸发沉淀；④冲洗时不能先倒掉染液，应以细流水从一边开始冲，防染料沉着，冲洗时间也不能长；⑤染色过淡时可复染，复染时先将染料稀释好；⑥染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色；⑦分类最佳区域为体、尾交界处。第一节流动的组织──血液──血液一、教学目标1.描述血液的成分和主要功能。2.使用显微镜观察人血的永久涂片，尝试识别红细胞和白细胞。二、教学策略血液对于每个学生来说既熟悉又陌生。说学生熟悉血液，是因为每个学生几乎都有流血、抽血和验血的经历，对血液的颜色等有一些感性的认识，还可以从报刊、杂志、电视和广播中获取到有关血液的信息。说学生对血液陌生，是因为学生大都不知道血液里到底含有哪些成分，以及每种成分各有什么功能。总之，学生对血液感到很新鲜，甚至有一些恐惧。因此，教师可以先让学生自由发言，交流各自对血液的认识，以激发学生的学习兴趣。然后，教师可以出示一张医院的血液化验单，让学生回忆和讨论血液化验的主要内容。教师可以将学生的回答记录在黑板上，为后面的教学做铺垫。当然，学生的回答往往不很全面，不很系统。这时，教师不要忙着补充，而是要及时评价学生从生活经验和课本外获取信息的能力，鼓励学生继续积极补充，再进行归纳，为下一步的教学打好基础。教师可以将课前准备好的血液分层演示装置(可以用鸡、鸭或家鸽的血，也可以用猪、牛或羊的血)演示给学生看，并让学生讨论资料分析中的3个问题。关于血浆，教师只需作简要的介绍。需要指出的是，水占了整个血浆的绝大部分，这可以为后面介绍无偿献血做铺垫。关于血细胞，教材的意图是让学生先通过显微镜观察人血的永久涂片，从感性上认识红细胞、白细胞的形态以及数量多少，然后从理性的角度进行学习，这样做可以激发学生自主学习、积极开动脑筋和主动求知的学习热情。在这一部分内容的教学中，教师介绍红细胞、白细胞和血小板的主要功能时，应该特别注意与生活实际中的一些问题相联系，如贫血、化脓和伤口处血液逐渐凝固等，这有助于调动学生的学习积极性，并加深学生对基础知识的理解和记忆。三、参考答案资料分析1.血液中含有不同的组成物，它们的质量不一样，所以，含有抗凝剂的血液离心或静置一段时间后，就会逐渐分成上下两层以及中间一薄层白色物质。2.血液是由上层的淡黄色半透明液体，下层深红色部分以及中间的很薄的一层白色物质组成的。红细胞和所含的血红蛋白在下层深红色的物质里，白细胞和血小板在中间很薄的一层白色物质中。3.血液中有大量的血细胞，这些细胞与血浆共同构成血液，完成物质运输等功能，因此，血液是一种组织，属于结缔组织。血液可以流动，因此称做“流动的组织”。实验1.数量最多的是红细胞。2.红细胞呈两面凹的圆饼状，红色，数量多，不用染色就可以观察到；白细胞的个体比红细胞大，数量少，只有经过染色才能观察清楚。3.血小板比红细胞和白细胞小许多，并且需要进行特殊的染色，所以在光学显微镜下看不到血小板。练习1.大量出汗时，血液主要丢失水分和一部分无机盐。通常采用喝水和适量补充无机盐的方法，来补充血液中丢失的这些成分。严重腹泻时，人体主要丢失水分、一部分无机盐和葡萄糖等营养物质。通常采用喝水、适量补充无机盐以及静脉滴注(或口服)葡萄糖溶液等方法来补充血液中丢失的这些成分。2.贫血患者的症状是：面色苍白并有头昏、乏力、心悸、气急等症状。血红蛋白是一种含铁的蛋白质，一般地说，贫血患者应当多吃一些含铁的食物和蛋白质丰富的食物。3.昆明属于高原地区，同平原地区相比，空气中氧的含量比较少。在这种环境下集训，可以增加足球运动员血液中血红蛋白的含量，从而增强足球运动员血液的供氧能力。4.白细胞吞噬了病菌和死亡的细胞后，自己也会死亡，所以白细胞的寿命比较短。四、背景资料人血常规化验单说明表下表是我国有关RBC、WBC、Hb和PLT的正常参考值和说明。检查项目正常参考值说明英文缩写中文名称RBC红细胞计数男：(4.0～5.5)×1012个/L女：(3.5～5.0)×1012个/L人体在运动、饱食和缺氧等情况下，红细胞数会暂时增加。贫血时，红细胞