第十二讲基因工程与细胞工程

1第十二讲基因工程、细胞工程与胚胎工程一．基础知识回顾1．基因工程的基本工具限制酶DNA连接酶载体作用切割目的基因和载体拼接DNA片段，形成重组DNA分子携带目的基因进入受体细胞作用部位两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键作用特点(条件)(1)识别特定的核苷酸序列；(2)在特定位点上切割DNA分子(1)E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；(2)T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端(1)能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；(2)有一个至多个限制酶切割位点；(3)具有特殊的标记基因2．基因工程的操作程序(1)目的基因的获取①从基因文库中获取。②利用PCR技术扩增：其实质是在体外对目的基因进行大量复制。③用化学方法人工合成a．对于核苷酸序列已知的直接人工合成。b．可通过反转录法获取，即mRNA逆转录酶,单链DNADNA聚合酶,双链DNA。(2)基因表达载体的构建①基因表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。②基因表达载体的构建方法(3)将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等显微注射技术感受态细胞法(Ca2＋处理法)受体细胞体细胞受精卵原核细胞(4)目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带2第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术(DNA和mRNA之间)是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同3．细胞工程的几个流程图比较细胞工程技术技术过程图示植物组织培养动物细胞培养植物体细胞杂交动物细胞动物细胞融合核移植3单克隆抗体的制备5．容易混淆的三种细胞——杂种细胞、重组细胞和杂交细胞(1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉细胞壁之后形成的原生质体融合，融合的原生质体出现细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。(2)重组细胞：体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。(3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。6．从结果来分析原理(1)植物体细胞杂交：植物体细胞杂交包含两个过程，一是植物细胞融合，二是杂种细胞的植物组织培养。其最终结果是形成杂种植株，产生了一个生物体，因此其原理是：细胞膜的流动性和细胞的全能性。(2)动物细胞融合：动物细胞融合形成杂交细胞，杂交细胞进行细胞培养，获得大量的克隆细胞，但没有形成生物体，因此动物细胞融合的原理是细胞增殖和细胞膜的流动性，不包含细胞全能性。7．对细胞核移植技术的分析(1)细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。(2)克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。(3)核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同的原因：①克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其线粒体中的DNA来自于去核卵细胞。②性状受基因与环境共同影响。③在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。8．早期胚胎的发育过程49．胚胎工程的操作流程图10．区分几个易错点(1)区别两种标志及可移植时期①受精的标志：看到两个极体。②受精完成的标志：雌雄原核融合成合子。③可以移植或分割的阶段：桑椹胚和囊胚。(2)“冲卵”的不同①胚胎移植过程冲出的是早期胚胎。②体外受精过程冲出的是卵子。(3)胚胎移植过程中的不同①两次使用激素：第一次对供、受体进行同期发情处理；第二次用于供体的超数排卵。②两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体是否妊娠进行检查。二．错混判断1.制备原生质体时可将材料置于加有纤维素酶和果胶酶的清水中。2.PCR反应中两种引物的碱基之间应互补以保证与模板链的正常结合。3.目的基因必须位于重组质粒的启动子与终止子之间才能进行复制。4.为了保证细胞培养的无毒环境，需大量添加各种抗生素。5.胚胎移植时，供体和受体必须处于同期发情状态。6.给母牛饲喂含有促性腺激素的饲料可促使其超数排卵。7.治疗性克隆不以个体出生为目标。8.定向诱导分化的实质是基因人为控制下的选择性表达。9.PCR技术扩增目的基因的特点是边解旋边复制。10.与动物细胞培养不同，胚胎的早期培养不需要添加血清等物质。11.胚胎分割可以看做是动物无性繁殖或克隆的方法之一。12.基因工程和植物体细胞杂交育种均能定向改变生物性状。13.利用PCR技术奖某小片段DNA扩增n代需2n-1对引物参与子代DNA的合成。14.在保持反应体系温度恒定的条件下，PCR扩增就能正常进行。15.胚胎干细胞在体外培养能增值但不能定向诱导分化。16.胚胎工程的理论基础是体外受精和早期胚胎的发育。17.人工冲卵是指从雌性动物的输卵管中冲取卵子。18.胚胎移植时对供体牛和受体牛都要进行同期发情处理。519.人的生长激素基因能在小鼠细胞中表达，说明遗传密码具有通用性。20.采用DNA分子杂交技术，能检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达。21.启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。22.微型繁殖技术既能保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。23.在卵细胞膜和透明带的间隙观察到两个极体是判断卵子受精是否完成的重要标志。24.胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点。25.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程。26.转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加。27.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接。28.应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。29.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列。30.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸。三．真题演练1.（2015重庆卷）6.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用2.（2014广东卷，多选）利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图14所示，下列叙述正确的是A、过程①需使用逆转录酶B、过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因C、过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D、过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞3.（2014重庆卷）4图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上6C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异4.（2014江苏卷，多选）下列关于基因工程技术的叙述，错误．．的是A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达5.（2014浙江卷）3.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是A.连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型B.某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞C.由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状6.(2015江苏卷)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_________。(2)图1中启动子是_________酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是_________。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有_________。(4)β-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于_________。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链,且β-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为_________。(6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是_________,理由是_________。7.(2015江苏卷)荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针,与染色体上对应的DNA片段结合,从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题:7(1)DNA荧光探针的制备过程如图1所示,DNA酶I随机切开了核苷酸之间的_________键从而产生切口,随后在DNA聚合酶I作用下,以荧光标记的_________为原料,合成荧光标记的DNA探针。(2)图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸,使DNA双链中_________键断裂,形成单链。随后在降温复性过程中,探针的碱基按照_________原则,与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有_________条荧光标记的DNA片段。(3)A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组,已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交,则其F有丝分裂中期的细胞中可观察到_________个荧光点;在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到_________个荧光点。8.（2015安徽卷）科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图。（1）由过程①获得的A为_____________________。（2）在核移植之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，目的是_______________________。受体应选用___________期卵母细胞。（3）进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生______________，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。（4）采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊，这是因为__________________________________________________。9.(2015福建卷)GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：8（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是。（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的限制酶进行酶切。（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。