第四章_多肽蛋白药物和基因转运载体材料

1第四章多肽蛋白药物和基因转运载体材料第一节多肽蛋白药物的特点多肽和蛋白质广泛存在于生物体内，具有多种多样的生理生化功能，也是一大类具有药用价值的生化物质。多肽类药物通常是指多肽类激素，一般将少于90个氨基酸残基组成的蛋白质列入多肽范畴（分子量在10KDa以下），但是超过20个氨基酸残基的多肽与蛋白质之间并没有明显的界限，有学者将胰岛素（由51个氨基酸残基组成）当作是最小的蛋白质。蛋白质是一切细胞、组织、器官的基本组成部分，是生命的物质基础，人们对它的研究开始于19世纪中叶。蛋白质由大约20种氨基酸按照不同的顺序排列组合而成，氨基酸的排列顺序决定了蛋白质千变万化的四级结构，从而也决定了某个特定蛋白质与众不同的理化特性与生理功能。自然界存在的多肽，除了有些是蛋白质降解产物外，体内已知的活性多肽主要是由下丘脑、垂体、胃肠道等部位产生的多种具有特殊生理功能的激素。就人体而言，几乎没有器官不分泌肽，就是脑与心脏也不例外。研究表明，人体器官所分泌的这些生物活性物质具有极其重要的功能，在生命过程中起作重要的调控作用，与人（动物）的生长、发育、免疫、代谢、生殖、疾病、学习、记忆、衰老、死亡乃至精神状态都密切相关。使用多肽蛋白质药物，必将影响人体的生理病理过程，从而加速或缩短疾病的自然进程。自1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素以后，多肽蛋白质的研究取得了很大的进展，许多多肽蛋白质药物已经应用于临床并取得良好的治疗效果，如胰岛素、干扰素、降钙素、白蛋白、丙种球蛋白等。在基础研究和临床使用的过程中，人们发现多肽蛋白质药物具有以下特点：（一）生物活性大，生理作用强通常情况下，多肽在人或动物体内浓度很低，在血液中一般为10-10～10-12mol/L，但是其生物活性很大，生理作用很强，在调控细胞生长、维持内环境稳定方面起到了重要作用。如生长激素、胰岛素等。多肽及蛋白质作为药物应用于临床同样具有这一特点，例如粒细胞集落刺激因子，通常每天应用75微克，连用三天左右就可起到明显的升白细胞作用。干扰素也是如此，在治疗带状疱疹时，短期使用（通常三天）就可见到显著的抗病毒效果。2（二）稳定性差多肽或者蛋白质发挥正常的生理功能常常依赖于特定的空间结构以及适宜的内环境。影响蛋白质分子活性的结构因素主要为氨基酸及其排序、末端基团，肽链和二硫键位置等。此外，二维、三维结构也同样影响生物活性。内环境或其空间构象的改变直接影响到蛋白质功能的异常。由于蛋白质自身结构的特点，加之多肽蛋白质药物所处的外周环境不像人体内环境那样易于保持稳定，多肽蛋白质药物容易发生水解、氧化、消旋、脱酰胺、变性、吸附、聚集或沉淀，从而降低了效价或完全失去作用。因此，多肽蛋白质药物的生产、保存以及使用过程一般都有较为严格的要求，以保持其稳定性。（三）两性解离蛋白质一端为氨基，一端为羧基，在其侧链上还有酸性或者碱性的基团，蛋白质的酸碱性取决于其酸性或者碱性基团的比例。蛋白质既可在酸性溶液中解离成阳离子，也可在碱性溶液中解离成阴离子，因此，蛋白质是呈两性解离的电解质。（四）能与阴阳离子结合阳离子形式的蛋白质可与三氯乙酸、磺基水杨酸等的阴离子形成不溶性的盐，而阴离子形式的蛋白质也可与重金属阳离子形成不溶性的盐。此外，阳离子形式的蛋白质还可以同阴离子形式的蛋白质相互结合形成盐。这一特性可用于蛋白质的分离纯化。（五）可形成亲水胶体蛋白质多肽对水的亲和力比较大，在水溶液中可以形成亲水的胶体颗粒。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒表面带有电荷和水化层。同种电荷相互排斥，加之水化层的隔离作用，使得胶体颗粒之间不会因为相互聚集而发生沉淀，从而保持其稳定性。（六）体内半衰期短，清除率高蛋白质易受体内酶、细菌以及体液的破坏，也因为其为“异己成分”，易被机体免疫系统排斥。因此，多肽蛋白质类药物在血液中的半衰期一般都很短，静脉注射后很快就被清除或者降解。如－干扰素静脉注射半衰期约1.5小时，－干扰素约为70分钟，－干扰素则不足30分钟。（七）生物膜透过性差3多肽及蛋白质的分子量常为数千至几十万，颗粒较大，不能透过半透膜。因此多肽蛋白质药物常常不直接进入靶细胞，而是首先与分布在靶细胞表面的特异性受体或者配体结合，通过某些特定的信号通路，产生最终的生理效应。也有的蛋白质药物是通过改变血浆的渗透压而发挥生理效应的，如人体白蛋白，其主要的生理功能就是维持血浆正常的胶体渗透压。（八）非注射给药生物利用度低多肽蛋白质药物非注射给药生物利用度很低，一般都仅为百分之几，如狗口服亮丙瑞林醋酸酯的生物利用度低于3％。因此，多肽蛋白质药物常常需要静脉给药，这给患者带来了很大的不便。（九）价格昂贵多肽蛋白质药物价格一般比较昂贵，如肿瘤治疗中的单克隆抗体、集落刺激因子，治疗消化道大出血的生长抑素等。（十）有免疫原性近20年来，重组蛋白药物的使用是生物技术的巨大成功，它也给人们带来了极大的希望。到目前为止，已有几十种重组蛋白质多肽药物应用于临床。但是对机体而言，药用的多肽蛋白质为“异种蛋白”，具有免疫原性，长期使用容易产生抗体，被机体所耐受，临床上可观察到药物的疗效降低。一个大型的研究比较了重组人胰岛素和猪胰岛素的免疫原性，在连续使用12个月以后，使用重组人胰岛素者抗体阳性率为44%，使用猪胰岛素者为60%。又如在对217例肿瘤病人的临床研究中发现，持续静脉滴注白细胞介素－2（IL-2）的患者有52%产生了抗IL-2抗体，与此同时，皮下注射IL-2的患者中有47%产生了抗体。此外，临床常用的干扰素以及集落刺激因子都有不同的免疫原性。（十一）可作为其它药物的载体多肽药物（如对靶细胞具有导向作用的单克隆抗体）如果连接上放射性核素或者毒素，则可将其特异性地集中在靶细胞部位,从而大大降低毒素以及放射性核素对全身的毒副作用，同时增强对靶区的杀伤作用。此时，多肽担当了其它药物载体的角色。此外，有研究者考察了聚L－天冬氨酸作为地塞米松载体治疗大肠功能紊乱的应用前景，结果显示聚L－天冬氨酸对于特异性结肠药物释放是合适的载体。因此，多肽蛋白质药物本身可以作为其它药物的载体。4第二节多肽蛋白药物对载体材料的要求随着生物工程技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现，目前已有多种重要治疗药物上市并应用于临床。目前生物技术药物研究的重点是应用基因重组技术开发可应用于临床诊断治疗的多肽蛋白质药物（包括酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等）。但是由于多肽蛋白质药物具有稳定性差、体内半衰期短、易被降解、非注射给药生物利用度低等特点，因此多肽蛋白质药物对其载体有如下一些相应的要求。当然，满足的条件越多，载体材料就越理想。（一）对正常细胞和组织无损害或抑制作用作为应用于机体的药物，其载体不应该损害正常的细胞和组织，并且不能影响正常的生理生化过程。（二）具有靶向性人们在治疗许多疾病的时候常常需要靶向性的药物（如抗肿瘤药物），但多数多肽蛋白质药物本身是没有靶向性的，因此就只能在载体上想办法了。例如作为载体的脂质体，由于经静脉注射后易被吞噬细胞摄取，从而富积于网状内皮细胞系统，因此脂质体是治疗网状内皮细胞系统疾病的理想药物载体。（三）可生物降解或者代谢成无毒物质，并排出体外多肽蛋白质药物最终是要进入机体发挥作用的，作为运载工具的药物载体也会随之进入机体。为了减少载体材料本身对机体的影响，它应该是可以生物降解或者在体内代谢成无毒物质，并随尿液、汗液等排出体外。（四）可增加药物的理化稳定性蛋白质多肽药物本身稳定性差，因此在使用上受到很大的限制。有的载体可以增加药物的理化稳定性，如脂质体、-环糊精包含物等。（五）能改善药物在体内的转运过程，延长药物的作用时间多肽蛋白质药物进静脉注射后很快就被清除或者降解，这显然不利于对疾病的治疗。研究发现，通过改变脂质体载体的表面积大小、表面电荷、组成成份以及给药途径，可以改变脂质体在给药部位的消除速度以及进入靶区的速度，从而使其在体内维持较长时间。（六）能改变给药途径多肽蛋白质药物多数只能静脉注射给药，这给患者带来极大的不便，特别是那些需要经常接受药物治疗的患者。此外，多次静脉给药也增加了感染的机会。5近年来，改变多肽蛋白质药物的给药途径成为了研究的热点，如雾化吸入给药、口服给药、经皮给药等。（七）无免疫原性载体是多肽蛋白质药物的运载工具，将与其同时进入机体。如果机体对载体本身产生排斥，势必影响药物的使用。因此，理想的载体是没有免疫原性的。（八）不影响药物的疗效多肽蛋白质药物稳定性差，在使用或者保存过程中容易变性或降解，从而影响疗效。因此，多肽蛋白质药物的载体本身应该比较稳定，并且在制备工艺、储存以及在体内降解的过程中都不应该有影响蛋白质多肽空间结构的情况出现。换言之，载体不应该影响蛋白质多肽药物的疗效。第三节多肽蛋白药物的载体材料随着生物技术和基因工程的飞速发展，越来越多的蛋白质多肽药物在重组DNA技术的帮助下被合成出来。这些重组蛋白是天然多肽蛋白质的化学复制品，并具有与其几乎完全一致的生理生化功能和药理学特征。虽然小剂量的重组蛋白在动物实验中显示出极大的特异性的生理活性，但是其中许多药物还不能应用于临床。如果口服给药，这些多肽蛋白质很快就被胃肠道的蛋白水解酶降解。如果静脉或者肌肉注射，由于其生物半衰期短，患者常常需要重复给药，这很难被患者接受并且要承担感染的风险。因此，发展不同的药物制剂，特别是口服给药制剂，已成为目前多肽蛋白质药物发展的方向之一。而发展不同的药物制剂就必须要发展与之相应的不同的载体材料。多肽蛋白质药物常用的载体材料有：（一）胶原胶原（collagen）是人们熟知的一种蛋白质，是脊椎动物的基本结构物质，也是哺乳动物体内含量最多的蛋白质。它由纤维母细胞合成，相对分子量约300Kda，结构特征为三条多肽链相互缠绕，在组织和器官的形成以及细胞功能的表达方面都具有非常重要的作用。迄今为止，已经报导的胶原类型有大约19种。1.特点胶原作为多肽蛋白质药物载体材料具有易塑形、亲水性高、对机体毒性低、可生物降解、组织相容性好等优点，因此，胶原在医药学上有着广泛的应用。（1）来源广泛：胶原大约占机体总蛋白的20～30%，并且容易提取和纯化。6作为蛋白质多肽药物的载体材料，胶原的来源丰富。（2）容易塑性：胶原容易被提取并制备成水性溶液，特别是在酸性的溶液中，因此根据模具的不同，可以将胶原制造成不同形状的载体。（3）亲水性高（4）低免疫原性：胶原的免疫原性主要来自其末端非螺旋末端肽，如果用胃蛋白酶除去末端肽，缺失胶原的免疫原性就大大降低，可以满足多肽蛋白质药物对载体材料的要求。（5）可被生物降解或者被重吸收（6）对机体无毒性（7）生物相容性好（8）相对稳定：胶原是机体的结构蛋白之一，在体内与其它多肽蛋白质相比较为稳定。但是，作为一种蛋白质，胶原对特定酶的降解较为敏感，如胶原末端肽清除酶和胶原酶。2.如果将胶原作为多肽蛋白质药物的载体，应该考虑胶原的下列不足之处：（1）过敏反应：胶原本质是蛋白质，如果是异种来源，理论上有产生过敏反应的可能。事实上临床发现由胶原引起的过敏反应很少，仅有两例对牛胶原过敏的报导。这两例报导均为眼科手术病人，临床表现都是结膜水肿。目前尚无严重变态反应的报导。（2）部分胶原（如Ⅰ型胶原）成本较高（3）机械强度不足（4）制造工艺不够完善：胶原在特定酶存在的情况下容易降解，此外，由于胶原纤维直径大小、交联情况的不一致，在分离胶原时也有一定的变异性。组织工程的最新进展将促进对胶原的研究，从而改善制造工艺，从天然胶原材料中提取性能更好，重复性强的生物材料。（5）其它副作用：如胶原移殖时伤口局部的红肿，胶原材料的矿物化以及牛海绵状脑病的风险等。随着胶原材料在临床的广泛应用，可能会有一些新的罕见的副反应出现。但是，胶原容易塑形、对机体毒性低、易生物降解、组织相容性好等优点使得胶原成为多肽蛋白质药物较为理想的载体材料。3．以胶原为材料的多肽蛋白质药物递送系统（1）在组织工程中的应用：在组织工程中，常常需要用到生长因子，如修复7骨的缺损。通常在骨缺损修复中采用的生长因子载体材料为钙磷陶瓷、冷冻脱矿异体骨、α－聚酯等。胶原因其具有良