第四章放射自显影技术.

第四章放射自显影技术•第一节放射自显影的基本概念•一、放射自显影的定义•利用放射性物质发出的射线能使照相乳胶感光的这一特性，来检测样品中的放射性的技术，称为放射自显影技术。•将放射性样品在黑暗中与照相乳胶接触在一起，即使照相乳胶暴露于射线中，射线使乳胶中的溴化银感光，产生潜影，经定影，定影后在乳胶上形成与样品中放射性物质所在的部位和活度相对应的有银粒组成的图象。•放射自显影技术是利用放射性样品能在照相乳胶上产生图像的特性来检测样品中放射性及其分布的一种同位素示踪技术。•二、制作放射自显影的基本过程•生物材料的标记→自显影样品的制备→自显影的制作→曝光→显影→定影→观察与分析（定位及放射性测量）。•三、放射自显影的基本类型•依样品和观察部位的大小，分宏观和微观自显影；后者又有光学自显影（IMARG）和电镜自显影（EMARG）。•1、宏观自显影将宏观的标记样品与固体照相乳胶接触曝光，显影，定影后，形成黑白图象，用肉眼观察或光密度计测量黑度来分析放射性物质在器官组织中的分布情况。•2、光学显微自显影通常在常规的组织学切片或涂片上涂上一层液体乳胶膜，经曝光，显影，定影后，在显微镜下观察银颗粒的分布，来了解放射性标记物在细胞间或细胞显微结构中的分布情况。观察的范围很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳胶膜的制作及观察分析上要求更高的技术。•3、电镜自显影在超薄切片上涂上单层乳胶膜，经曝光、显影、定影后，在电子显微镜下观察银颗粒的分布，来了解放射性物质在细胞超微结构中的分布情况。甚至可观察到生物大分子的标记部位。观察的结构部位很小，要求分辨力高，在材料标记，切片制作，乳胶膜的制作及观察分析上要求更高的技术。放射自显影技术Northern杂交ratbrainRadishleaf•四、放射自显影的特点•ARG既是一种辐射探测方法，又是一项完整的同位素示踪技术。它与一般用制备的放射性样品，通过电离或闪烁探测器检测放射性的示踪技术相比，有下列主要优点：•1、能够准确定位依自显影的类型不同能检测放射性物质在器官、组织、亚细胞结构、甚至在生物大分子中的分布。至于用自显影获得的细胞，亚细胞和分子水平上放射性物质的分布是用一般的生物化学分离法难以获得或不能获得的。•2、具有很高的灵敏性因为照相乳胶对射线的反应具有累积作用，所以通过延长曝光时间可以检测到样品中微弱放射性。•3、资料形象，易于保存获得的自显影图像能清晰反映放射性物质在器官、组织、和各结构部位的分布情况，形象、客观并能长期保存。•虽然放射自显影技术有着其他方法无法比拟的优点，但同样存在一些不足之处：•1、自显影的制备时间过长手续较复杂，尤其显微自显影要求较薄的技术；•2、不能直接定量一般情况下只能相对定量。因此，除了在细胞学、分子生物学和遗传学研究中的特殊目的外，在一般的示踪实验中，放射自显影作为放射性检测的一种手段，补充提供放射性物质的吸收，运转和分布的资料。•第二节宏观放射自显影（Macro-autoradiography）的制作•以宏观材料制作的自显影，肉眼或光密度计观察组织、器官中放射性物质的分布。•一、样品的制备•1、植物材料整株或部分器官（枝条、叶片、花蕾等），压制成标本要求干而不脆，平整。若植株过大可折转或剪断。若观察放射性物质在茎杆中的分布，可制成茎杆的纵横切片。•2、动物材料整体切片：纵剖面或横剖面，或组织的宏观切片。•3、层析谱纸层或薄层板展开后，充分干燥，可喷射聚氯乙烯或硝化纤维（polyvinylchlorideornituocellalose），以防止自显影时薄层板上吸附剂粉的移动。•4、凝胶电泳块为防止水分对乳胶的影响可采取：（1）干燥；（2）包蔽；（3）冰冻：在低温条件下曝光。•5、其他如土壤剖面，可将土壤切成平整的剖面，用薄的聚氯乙烯膜包蔽。•二、自显影的制作•1、感光材料通常为乳胶，其基本组成为溴化银晶体、支持物、明胶（溴化银晶体的支持物）。•各种感光材料主要由于银盐的浓度，结晶颗粒的大小和乳胶层的厚度不同而具有不同的敏感度和分辨能力，适于不同目的的自显影。颗粒越大、越多，即越容易形成潜影。而分辨力与颗粒的大小和乳胶层的厚度相关。•照相乳胶的类型有X光片、幻灯片或电影正片、核乳胶、乳胶干板、加强膜（荧光片增强感光）、照相底片。•2、自显影的制作一般采用接触曝光，将样本平整的一面与X光片或其它固体照相材料紧密接触，样本的另一面填上泡沫塑料等松软材料。X光片上覆盖一层薄纸，压紧，使其和样本紧密接触。市售的X光曝光盒底层有泡沫塑料，放一张保护纸后，放样本，X光片在样本上面，再覆盖保护纸将盖子扣紧，就能完全曝光。为防止薄层板上分离的纯化学物质或土壤中的化学物质对感光材料的作用，可再薄层板或剖面上加保护膜，这对32P样品没有影响，对14C、35S等软β核素，可能将一部分射线挡除，而对3H则完全把射线隔断。•三、照相过程•1、曝光•（1）潜影的形成过程射线粒子进入晶体，能从溴离子中打出电子，形成电子与银离子的离子对，只要能量足够，这个电子能离开轨道，进入导电带，在晶体内移动，并移向缺陷处，形成阴电层，银离子向阴电层移动，获得电子，形成银原子，银原子聚集形成潜影。同时，失去电子的溴离子成为溴原子，并从晶体表面释放出，跑到明胶中。•（2）曝光条件紧密曝光，固定，安全曝光，无外源放射性，安全位置，别人不会拿动或作上标记，湿度不能太高，低温下能增加敏感度。•（3）曝光时间曝光时间不足，来不及形成潜影，不能得到显影形象。因为在一般显影条件下，要使银粒显影，需要有一定的银粒数及每粒含有一定数量的银原子数。曝光时间过长，本底增加，降低了分辨力，特别是β射线，由于散射使形象模糊。在曝光时间过长情况下，有时感光度反而降低，因为银原子与溴原子重新结合，称为潜影衰退（imagefadding）。过量的水分，大气中的O2、H2O2过大或不均匀的压力，过高的温度都能增加潜影衰退。因此在曝光之前必须使乳胶完全干燥，如需长时间曝光，可除去空气，在N2或氩气中暴光，并且在低温下进行。•曝光时间的长短和射线的种类(能量、半衰期)、活度和感光材料的类型及自显影的种类有关，同时也要考虑到放射性分布的无均匀性。•对X-光片，105～106粒/cm2能产生可显影的潜影，107～1010粒子/cm2产生好的潜影。因此可以此数除以单位面积样品的放射性活度（dpm/cm2）来粗略的估计曝光时间（t=(dpm/cm2)/(107～1010粒子/cm2)，再结合实验曝光确定适宜的曝光时间，即在正式制片的同时，压制相同样品的预备片，在不同时间取出显影，直至出现清晰的图象。•2、显影显影过程是在显影剂的作用下，使感光的银颗粒还原，使潜影显现出来。是一个自催化的过程，在还原已开始的晶粒中比还原还没有作用的晶粒还原的快，因此在含有潜影银的晶粒中首先开始作用，溴化银转化成银原子，聚积在潜影形成的位置上，溴离子从晶粒中扩散出去。在没有潜影的银粒中也能显影，但要慢的多，显影要掌握在正好使感光晶粒还原，而未感光的晶粒还未还原，结果使形象显示出来。•显影液一般用D19-6或市售的显影粉配置。温度在19±1℃，时间一般在2～3min。•3、定影定影剂的主要成分是Na2S2O3（硫代硫酸钠），目的是去掉未显影的晶体颗粒，使图像得以长久保存。•其反应式如下：•Na2S2O3+AgBr→NaAgS2O3+NaBr；•NaAgS2O3+Na2S2O3→Na3Ag(S2O3)2。•定影的时间一般为15min或更长，温度控制也没有显影过程那么严格。定影完成后，充分水洗，除去定影剂和硫化物，然后凉干。•四、宏观自显影（Macor-autoradiography）的观察•1、肉眼观察观察发黑的部位和程度，如果放射性只分布在个别部位，或放射性比较弱，发黑不明显，必须有实物照片比较观察。用X－看片灯可以观察的比较清楚。•2、光密度测量肉眼观察只能获得不同器官或组织放射性多少的相对印象，不能给出具体的数据。光密度测量是用光密度计测量透过部位的光的强弱，对底片黑化程度能给出定量数据。因此能较客观评价各部位、器官、组织的放射性的相对分布。这种自显影定量的关键在于制备和应用放射性阶标。即用逐级降低的已知放射性活度的阶梯性标准（简称为放射性阶标），与待测样本一起曝光和加工，通过与阶标的黑度相比，来确定标本的放射性（参考王成方等“大豆光合产物运转分配的定量自显影研究”原子核农业应用，1985，4：26-29）。•由于标本各处的组织结构的差异，自吸收及对乳胶接触的几何条件不同，因而必须对用阶标法测出的标本的放射性活度进行修正后，才是标本的实际放射性活度。即在自显影后，将标本的代表性部位取下，称量，并液体闪烁计数仪测量放射性，与自显影片的值相比较，求出R值（R=标本液闪测得放射性活度/自显影测得的放射性活度），再进行校正。（参见刘鼎新，放射自显影技术的一些新进展，1980，1，核医学进展；RogersA.W.，PracticalAutoradiograph，EnglandReview，1979，（20））。•第三节光学显微自显影（IMARG）的制作•IMARG是在光学显微镜的水平上观察放射性物质的分布，所用的样品通常是粘在载玻片上的切片。根据所研究物的性质和观察的结构部位的大小，制作不同厚度的包埋切片或细胞涂片。然后在切片上覆盖乳胶膜。经暴光，显影，定影后，连同切片一起观察乳胶中的银粒分布。•一、固定和包埋材料及切片的制备•1、石蜡包埋切片取新鲜的组织块（经放射性标记，0.5cm×0.5cm×0.5cm）→固定（保持新鲜状态的结构，一般采用卡诺氏Ⅰ（96%乙醇：冰醋酸=3：1V/V）或卡诺氏Ⅱ（96%乙醇：氯仿：冰醋酸＝6：3：1V/V/V）固定液固定24小时，若要保存核蛋白，可采用甲醛：70%乙醇：冰醋酸=5：90：5（V/V/V）固定液）→脱水（用逐级酒精脱水）→浸透（1/2二甲苯+1/2酒精→二甲苯）→透明（1/2二甲苯+1/2石蜡）→包埋（将融化石蜡中的组织块，量于用纸折成或特殊的包埋盒内的适宜位置，灌入融化石蜡，投入冰水中冷却）→修块（将样本周围所涂石蜡切掉，修成适宜切片的一定形状的蜡块）→切片→展片→脱蜡→复水→干燥。•若要在高倍显微镜下观察，制作0.5～1μm的半薄切片，则采用树脂包埋。其处理过程与上述基本相同，但要求更精细的操作，要用性能良好的切片机和玻璃刀。•2、冰冻切片冰冻切片用以研究可溶性的小分子放射性成分的分布，必须将新鲜组织块量于液氮冷却的异戊烷或丙烷中或干冰丙酮中快速冷冻，固定活体结构，防止冰晶形成，然后以不同方法进一步处理。•（1）组织块处理•①冻干－渗蜡首先深冻组织块，低温真空干燥，通过升华使组织脱水；然后真空渗蜡：冻干组织块置于试管固体石蜡上，抽真空后，在60℃水浴渗蜡。•②冷冻取代用有机溶剂取代水分子而使组织脱水。吉林农科院：在广口热水瓶中放入干冰，在有胶塞的试管中充入经无水硫酸钠反复脱水和蒸馏后的纯丙酮，插入干冰中预冷。速冻的组织块于低温干燥条件下迅速转入试管中，密封。并置于冰箱中，每天加干冰，一周后，拉试管胶塞于冰面中，自然升温至室温，取代完毕。•（2）恒冷切片箱中切片冰块装于恒冷箱切片机上，在低温下切片，切片浮于益玻片上，再将盖玻片于黑暗中沾于乳胶干板上，在低温下曝光，即为融表法。•二、显影的制作•1、固体乳胶法在低温显微镜下观察比较厚的组织切片的自显影，可用电影正片、幻灯片、乳胶干板或涂有液体乳胶膜的玻片，可用下列方法制备自显影：•（1）接触法•（2）湿贴法•（3）湿贴-接触法•2、液体乳胶法将核乳胶于40-50℃水浴中融化，稀释，轻轻搅拌均匀，用涂布法，滴加法，常用浸蘸法制备乳胶膜覆盖于切片上，待乳胶冷却、凝固、干燥后，置于暗盒中，加入干燥剂，黑纸包裹。为防止胀力显影，干燥过程不要太快。•核乳胶是对射线敏感，对普通光线相对不敏感，专为自显影而制造的照相乳胶。呈淡黄色，在常温呈牛乳状，平时必须保存于4～8℃冰箱中。•3、揭膜法揭膜乳胶如AR-10是10nm的明胶层上加一层5μm的乳胶层，使用时将其从玻片上连同明