计算机在生命科学中的应用作业

计算机在生命科学中的应用硫磺矿硫化叶菌碱基片段进行引物扩增前言：引物设计是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。引物设计原则1、长度：15—30bp，其有效长度一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。4、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。实验内容：试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列。实验步骤：用不同的限制性内切酶处理，用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到所需的的DNA片段，是理想的PCR模板。对目的基因所在片段进行分析，找到合适的引物及反应条件。使用PCR扩增得到目的DNA。首先我们要用限制性内切酶将多余的片段切去。找目的基因所在的片段。选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点。根据引物设计原则，.选择合适的引物，进行PCR扩增，就得到大量目的DNA片段。NEWMOL12389bpAaaI(11130)AarI(3418)AceII(11065)AdeI(980)Afa16RI(1655)Afa22MI(1655)AgeI(11935)AjoI(3370)AliAJI(3370)ApiI(3370)AsiAI(11935)Asp26HI(6886)Asp27HI(6886)Asp35HI(6886)Asp36HI(6886)Asp40HI(6886)Asp50HI(6886)Asp713I(3370)AspI(11468)AsuNHI(11061)AtsI(11468)BalI(11098)Bbr7I(11317)BbsI(11312)BbuI(8592)Bbv16II(11312)BbvII(11312)BciVI(8519)BfrBI(719)BfuI(8519)BloHII(3370)BlpI(7467)BmtI(11065)BpiI(11312)Bpu1102I(7467)BpuAI(11312)BsaMI(6886)Bsc91I(11312)BscCI(6886)BsePI(11207)BseX3I(11130)BshTI(11935)BsmBI(10297)BsmI(6886)Bsp1720I(7467)Bsp63I(3370)Bsp68I(11839)BspAAII(5239)BspBI(3370)BspBS31I(11312)BspCI(1655)BspIS4I(11312)BspMKI(4072)BspTS514I(11312)BssHII(11207)BstBS32I(11312)BstBZ153I(11207)BstGZ53I(10297)BstIZ316I(980)BstMAI(3370)BstRZ246I(4151)BstSWI(4151)BstTS5I(11312)BstV2I(11312)BstZI(11130)BsuBI(3370)CelII(7467)CflI(3370)CfrA4I(3370)CfuII(3370)由上图酶切位点可以看出，第980个碱基处的两个酶切位点对目的基因所在的DNA序列进行酶切后电泳，结果如下：由电泳结果可以看出，酶切后得到两条DNA片段，短的DNA片段即为目的基因所在片段。由引物设计原则对以上引物进行分析得最优引物序列为：Containsregionofthemoleculefrom80to832Tm:71.2CTaOpt:51.0CGC:29.7SensePrimer:CTGCAGGTGAGAAAACAACTCTCTSimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:24Tm:53.7CGC:45.8dH:-170.4kcal/moldS:-442.4cal/moldG:-36.7kcal/molAntisensePrimer:GAATTCGCAGATTTCCAGACAGAASimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:24Tm:56.4CGC:41.7dH:-177.6kcal/moldS:-459.1cal/moldG:-38.9kcal/molTmDifference:2.6GCDifference:4.2#2:Productoflength765(rating:171)Containsregionofthemoleculefrom80to832Tm:71.2CTaOpt:51.0CGC:29.7SensePrimer:CTGCAGGTGAGAAAACAACTCTCTSimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:24Tm:53.7CGC:45.8dH:-170.4kcal/moldS:-442.4cal/moldG:-36.7kcal/molAntisensePrimer:GAATTCAGCAGATTTCCAGACAGASimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:24Tm:54.2CGC:41.7dH:-170.2kcal/moldS:-441.0cal/moldG:-36.9kcal/molTmDifference:0.7GCDifference:4.2#3Productoflength764(rating:171)Containsregionofthemoleculefrom80to831Tm:71.2CTaOpt:51.0CGC:29.7SensePrimer:CTGCAGGTGAGAAAACAACTCTCTSimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:24Tm:53.7CGC:45.8dH:-170.4kcal/moldS:-442.4cal/moldG:-36.7kcal/molAntisensePrimer:GAATTCGCAGATTTCCAGACAGAATSimilarityofprimerwithout5'attachment:100.0%Length:25Tm:56.6CGC:40.0dH:-186.2kcal/moldS:-483.0cal/moldG:-40.4kcal/molTmDifference:2.8GCDifference:5.6结论：将PCR技术和限制酶切技术结合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR扩增产物，可以获得大量我们所需要的目的基因。