计算机在生命科学中的应用第四次作业

对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计实验目的：1.利用软件VectorNTIExplore对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的比较小的片段2.利用软件VectorNTIExplore进行引物设计引物实验材料：SulfolobussolfataricusP2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA序列。实验原理：1.引物设计的原则：A长度在18~35bp，GC含量在40%~60%之间，内部无发卡结构，Tm值最好接近72℃；B引物之间避免形成二聚体；C引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配；D在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。E.引物3′端不能选择A，最好选择T。F.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等实验内容：试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用VectorNTIExplorer分析酶切位点，依次用PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到1——1429的DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用VectorNTIExplorer分析，设计9的PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。1,首先我们要用限制性内切酶将冗余的片段切去。找目的基因所在的片段712389bpPstI(3370)ClaI(2372)ClaI(11744)HindIII(2494)HindIII(2828)HindIII(3066)HindIII(3884)HindIII(7373)NcoI(4042)NcoI(6593)NcoI(7472)NcoI(10443)NcoI(11425)EcoRI(1429)EcoRI(2696)EcoRI(3259)EcoRI(5730)EcoRI(5748)EcoRI(6201)SmaI(7369)SmaI(7492)SmaI(7560)SmaI(9182)SmaI(9210)SmaI(9867)SmaI(11687)XmaI(7367)XmaI(7490)XmaI(7558)XmaI(9180)XmaI(9208)XmaI(9865)XmaI(11685)AvaI(368)AvaI(7367)AvaI(7490)AvaI(7558)AvaI(7827)AvaI(8088)AvaI(8801)AvaI(9142)AvaI(9180)AvaI(9208)AvaI(9597)AvaI(9865)AvaI(11344)AvaI(11434)AvaI(11685)AvaI(12094)这是SulfolobussolfataricusP2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件VectorNTI所能找到的所有酶切位点：因为该物种中限制性内切酶PstI只有一个切点，且位于3370bp处，可以一次性出去一大段多余的部分，所以先用PstI酶切并进行电泳，选择琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图：113007002K5K10K20K100K10M电泳中DNA片段越大则跑的越慢，DNA片段越小跑得越快，所以0~3370bp应该跑得比另一条带快，可以回收跑得最远的那条带，那段序列应该是1~3370bp。83370bpAvaI(368)ClaI(2372)PstI(3370)EcoRI(1429)EcoRI(2696)EcoRI(3259)HindIII(2494)HindIII(2828)HindIII(3066)，113007002K5K10K20K100K10M为了一步就能得到我们想要的目的片段，在1~3370bp处，用EcoRI和ClaI双酶切再进行电泳，这样做的目的在于可以一步就能得到我们想要的目的片段，而且电泳后的条带清晰，在实验室中好回收。而用这两种酶切产生的片段长度分别1429bp，943bp，342bp，563bp，111bp，电泳结果如图：同理，我们将1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是我们需要的含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图9所示。用工具找它的ORF，ORF的分析结80~709bp处，91430bpAvaI(368)1AAAATCTTCCAATTATTTCAGTAGTGTCTATCTTTTAATATGAAAAATTTTTGATGTTTTAGTTTGAAAAATTTATTAAGTGAGAAAACAACTCTCTATTTTTTAGAAGGTTAATAAAGTCATCACAGATAGAAAATTATACTTTTTAAAAACTACAAAATCAAACTTTTTAAATAATTCACTCTTTTGTTGAGAGATAA101GGAATGAAGAATCTTTATAAAATTAACTTTTCAATATCACACCAAGGTTGCTGGACCAGCAAAATAAAAGATAGTGTTGTTACCTTAAATGTATCAAAATCCTTACTTCTTAGAAATATTTTAATTGAAAAGTTATAGTGTGGTTCCAACGACCTGGTCGTTTTATTTTCTATCACAACAATGGAATTTACATAGTTTTA201ATAATAATAAGAAAGTCAGAGTCACAATAGCTTCTCCAAAATTAATAGTAACTGACCTAAAAAGGTCAGAAAACGTTTACGAAATTCTAAAGTATAGAAATATTATTATTCTTTCAGTCTCAGTGTTATCGAAGAGGTTTTAATTATCATTGACTGGATTTTTCCAGTCTTTTGCAAATGCTTTAAGATTTCATATCTTTAvaI~~~~~~~301GGTAAAAGGGGGTTATATAATTGACTTCCTTGAAGATCTGAGTACTACAATTTCAGGATATATACTCTCGAGCAGTAATATATTAGAATATAGAAATGTCCCATTTTCCCCCAATATATTAACTGAAGGAACTTCTAGACTCATGATGTTAAAGTCCTATATATGAGAGCTCGTCATTATATAATCTTATATCTTTACAG401GTAAGGGAAGGAATAGAAAAGTGGGAAGTAACAACTTTAGCCAAATCTTTAGTAGGCAAATTATCAGAAAGATTTCCCATAGATAGCATTGTAGTTAAAGCATTCCCTTCCTTATCTTTTCACCCTTCATTGTTGAAATCGGTTTAGAAATCATCCGTTTAATAGTCTTTCTAAAGGGTATCTATCGTAACATCAATTTC501AAATAAAGTTTTCAGATATGTTCTATAATGGTTTGACAGAAAAGGAGATACTAGTCCTAAAAACCGCAATAACTATGGGATATTTCAATTATCCAAGGCATTTATTTCAAAAGTCTATACAAGATATTACCAAACTGTCTTTTCCTCTATGATCAGGATTTTTGGCGTTATTGATACCCTATAAAGTTAATAGGTTCCGT601AATAAAAGCTAAGGAAATTGCTGAAAAATTAGGTATCTCCAAGCAAGATTTCCTTTATCATCTGCGAAAATCAATAGAGAAAATAATTTTCTCATCAGTTTTATTTTCGATTCCTTTAACGACTTTTTAATCCATAGAGGTTCGTTCTAAAGGAAATAGTAGACGCTTTTAGTTATCTCTTTTATTAAAAGAGTAGTCAA701ATAGAATAGTAATTCATGCATATTAAATTACTAAAAATTTAAGTGATTAAAAAGGTTTAAAAATAATATAAGACTCCTTTATATTCAAAGACTATAATCATATCTTATCATTAAGTACGTATAATTTAATGATTTTTAAATTCACTAATTTTTCCAAATTTTTATTATATTCTGAGGAAATATAAGTTTCTGATATTAGT801CCGAACTTCTTAATTCTGTCTGGAAATCTGCTCTTTATCACATAATATGTAATTATGTGAATCAAAAGAATAGCCCAAGCTGCATAAACTGCTATATTTAGGCTTGAAGAATTAAGACAGACCTTTAGACGAGAAATAGTGTATTATACATTAATACACTTAGTTTTCTTATCGGGTTCGACGTATTTGACGATATAAAT901ATGGGAAAGCTGGCGCAGGGTAAGTACCAAAATATATTACAGCAATATATAATAGTATTGAAATTATCGGTATCACTACGTGTTTCGCTATGTTAGCCGTTACCCTTTCGACCGCGTCCCATTCATGGTTTTATATAATGTCGTTATATATTATCATAACTTTAATAGCCATAGTGATGCACAAAGCGATACAATCGGCA1001ACGCATTTTAACCTTACGTACAATTAACCCTAAGGCAGCAAATAAATGACCTAAGGCGACGTAGAATGAGCCAAATGTTATTAAAAATATACTAGCCTCTTGCGTAAAATTGGAATGCATGTTAATTGGGATTCCGTCGTTTATTTACTGGATTCCGCTGCATCTTACTCGGTTTACAATAATTTTTATATGATCGGAGA1101AACGGACCTAGAATGTAACCACTTATAAGGCTAAGAGCACCTGTAACAATACCAGTAAGTATTATTGCATTACCCGGCACACCGTATTTATTAACTTTTGTTGCCTGGATCTTACATTGGTGAATATTCCGATTCTCGTGGACATTGTTATGGTCATTCATAATAACGTAATGGGCCGTGTGGCATAAATAATTGAAAAC1201AAAAGACTTTAGGATATAATACACCATCCCTAGCCATACCGAATATCATTCTACTCCCACTAGTAGCAAACGCTAATGCAGAAGAGTTAAACATAAACGCTTTTCTGAAATCCTATATTATGTGGTAGGGATCGGTATGGCTTATAGTAAGATGAGGGTGATCATCGTTTGCGATTACGTCTTCTCAATTTGTATTTGCG1301TACAAGTATTATTAACATATATACAATAGCGGGATTGAAATACTTACTATAAATCACTATCATTGGGTCTGGAAGATTAGCATAATTAAACATATTATTTATGTTCATAATAATTGTATATATGTTATCGCCCTAACTTTATGAATGATATTTAGTGATAGTAACCCAGACCTTCTAATCGTATTAATTTGTATAATAAA1401ATTCCATAAACTATCGTCTGCGCATAAGAATAAGGTATTTGATAGCAGACGCGTATTCTT。2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点。PUC18:依靠LacZ’-基因的选择重组体的筛选：含有重组PUC18分子的E.coli细胞在含氨苄青霉素和X-Gal的琼脂糖板上只需一步就可识别出来。结果：其中白色菌落的含重组体，蓝色菌落得不含重组体。3.酶切位点的