精子冷冻复苏效果的影响因素

精子冷冻复苏效果的影响因素【摘要】不育症在世界范围内的发生率为l0％～15％，其中约有一半因素来源于男方。流行病学研究早已证实，近50年以来，男性精液的质量持续下降．男性精子几乎减少了一半并且每年还以2.1％的速度在减少。男性不育人数的增多甚至出现精子危机。为了应对精子质量的下滑，保存技术显得尤为重要。本文即对精子冷冻复苏保存的影响因素进行探讨与总结。【关键词】精子；冷冻复苏；精浆；精子危机；储存环顾四周，男性不育人群日渐增加，精子库也成为越来越多不育家庭求助的借精之地。实际上，“精子危机”是否存在在学术界也有争论。2013年欧洲人类生殖与胚胎学会伦敦年会上关于男性的精子危机仍争论不一[1]。中华医学会男科分会候任主任委员姜辉说，他所在的北京大学第三医院接诊的不育患者中，无精症男性比例从2004年的6%上升到2008年的10%。同时，世界卫生组织颁布的“精子质量合格线”一直在下降，至2010年为1500万个，已是30年前的四分之一。为了应对精子质量的下降，人类精子的冷冻保存则逐渐成为人类精子库及生殖中心工作的重要组成部分。其用途主要体现在：供精者精液保存、男性生育力保存、男性不育症的治疗及最大限度降低传染性疾病的传播。因此，精子冷冻复苏的效果也越来越受到重视。虽然我国人类精子库的数量较多，至2011年12月我国共批准建立了15家人类精子库。但需要的夫妇数量也很多，至今仍存在供不应求的情况，使得精子的储存越来越受到重视。影响精子冷冻复苏率的因素比较多，主要分为自身因素和非自身因素。本文通过查阅最近国内外文献，将影响精子冷冻复苏效果的因素分为实验室因素（冷冻保护剂、冷冻方法、复苏方法等）、精液自身因素（精浆因素、精子因素）及其他因素（季节、禁欲时间）等并作如下综述：1.实验室因素对精子冷冻复苏效果的影响近年来，有大量文献研究如何提高人类精子的冷冻复苏率，影响人精子冻贮后效果的实验室因素主要有：冷冻保护剂、冷冻方法、精液与保护剂的比例、精液处理后冷冻、精液复苏方法、冻存时间等。1.1冷冻保护剂研究表明，未添加冷冻保护剂的精子在冷冻贮存并复温后，仅有0.1%的精子具有一定程度的运动能力。在精子冷冻之前，为了减轻精子冷冻及复温过程中细胞的损伤，须加入一些具有保护作用的物质，这些物质统称冷冻保护剂。而精子细胞里的活性氧（ROS）具有很强的氧化活性，其浓度过高可以诱导细胞的脂类、蛋白及细胞内的DNA氧化损伤，从而引起一系列的病理变化。有些不育男性精液中缺乏与这些氧化物抗衡的物质，从而引起不育。有研究认为精浆中过多的ROS会导致精子的氧化损伤，以至于精子的功能受损以及精子核和精子DNA受损[2]。因此，ROS导致人精子的损伤，也可能降低精子对冷冻复温的抵抗能力[3]。有许多研究认为在冷冻保护剂中添加一些抗氧化物质（如：维生素E、抗坏血酸葡糖苷、谷光甘肽、抗坏血酸和过氧化氢酶等）可以保护精子功能，明显提高精子的冷冻复苏率。在冷冻保护剂中添加维生素E可以提高冷冻后精子的活动力及精子DNA的完整性[4、5]；在冷冻保护剂中添加抗坏血酸等物质可以提高精子冷冻复苏率，LI等研究发现，在精子冷冻保护剂中添加抗坏血酸和过氧化氢酶可以抑制ROS的活性，从而可以提高精子冷冻复苏率[6]。另外，添加谷胱甘肽（GSH）对精子冷冻损伤也有一定的保护作用[7]。但也有研究认为不添加保护剂直接冻存和添加保护剂对精子DNA完整性的影响无显著差异[8]。1.2冷冻方法根据降温速率不同将冷冻方法分为三种类型:快速冷冻法（液氮蒸汽法）、慢速冷冻法（程序冷冻法）和玻璃化冷冻法。目前，国内外许多研究认为采用快速冷冻法和慢速冷冻法两种方法冷冻后，人类精子冷冻复苏率无统计学差异，两种方法冷冻方法均可适用于常规的精子冷冻[9、10、11、12]。另外，通过玻璃化冷冻方法对精子进行冷冻也取得很好的效果。IsachenkoV等通过对上游法处理好的精液，用无冷冻保护剂与常规甘油保护剂的慢速冷冻方法比较，发现大体积的玻璃化冷冻方法对精子复苏后精子活力、精子膜完整性均高于普通的冷冻方法[13]。冷冻过程中与冷冻保护剂接触的时间和温度也会对精子冷冻复苏效果产生影响。冷冻保护剂在温度较高的情况下随着温度上升，毒性也随之增加。因此，在精子冷冻前，一定要注意温度不要过高，室温应该保持在20～30℃。同时，要注意平衡时间不宜太长。1.3复温方法与精子冷冻过程一样，复苏过程同样会对精子产生损伤。但精子复苏过程到目前为止，还没有得到一个最佳的精液复苏方法。一般认为水浴比在空气中复温速率更快，并且外界温度越高，复温速率越大。现有的复温方法大致包括37℃水浴、15℃水浴、冰水及室温空气中自然复温4种。有些研究认为4种复温方法效果大致相同，也有研究并不认同。有研究认为冷冻精子在40℃条件下复苏比在20℃与37℃之间复苏有更高的精子冷冻复苏率，但两种温度复苏后精子的顶体完整率、DNA一致性，ATP酶含量差异并没有统计学意义[14]。1.4精浆比例人类的精浆成份比较复杂，它的许多功能目前也没完全研究清楚。有研究认为精浆中的前列腺素E可以增加精子内的cAMP浓度[15]，以此来提高精子的运动能力；此外，Henricks等认为胰岛素样生长因子I及其在精子上的受体可以提高精子运动能力，尤其可以提高直线运动速率[16]。但也有研究认为精浆不利于精子受精。通常情况下，在进行宫腔人工授精时，精液常常洗涤以后使用以去除精浆对受精的影响[17]。对于精浆，不同配比的保护剂，保护效力也会不同。有研究显示，与精浆浓度50%相比，75%精浆可能具有更好的保护效果[18]。王学本等通过对含精浆浓度为0%,25%,50%,75%和100%的精子冷冻复苏率进行比较得出结论：一定的精浆浓度可以提高精子的冷冻复苏效果。即对某些不育患者的异常精液进行冷冻处理同时利用高冷冻复苏率的供者精浆置换不育患者精液的精浆可能获得较好的复苏效果[19]。1.5优选处理正常的精子可以耐受一定范围内的冷冻和解冻速率。然而，冷冻保存确实对人精子功能有不良效应，特别是降低精子活力。一般而言，冷冻和解冻后仅约50%的活动精子存活。优化冷冻保存程序可使冷冻损伤降到最低，并且可以由此增加妊娠率[20]。并且，冷冻前精液质量越好（精子浓度、精子活力、形态正常精子百分率），冷冻复苏后精子的活力就越高。因此，为了得到更高比例的活动精子，常常会在冷冻前进行精子的优选处理。这样的精子对冷冻复苏损伤的耐受性更强，精子的冷冻复苏率更高。1.6反复冻融这种影响主要表现在精子活力的影响。人类精液经过多次冷冻复苏过程，仍有一定比例的活动精子，但是，冷冻复温的循环次数越多，精子的活力和存活率就会越低。因此，必须应该尽量减少这种冷冻复苏的循环过程。有研究认为每经历一次冷冻复苏循环，精子DNA损伤率明显增加，精子活动力及存活率明显下降[21]。1.7储存时限从理论上讲，保存在-196℃的精子细胞，其代谢已基本停止，目前较为一致的观点是：如果储存的方式恰当，在很长的一段时间内精子的存活率不会有很大的变化，可以无限期地保存下去[22]。众多的研究结果也表明，精液在液氮中保存数日与数月乃至数年，复温后精子存活率相同[23]。YogevL等对储存了0.5-14.4年的共2525份精液标本研究发现，长时间的精液保存不会影响复苏后前向运动精子的浓度[24]。但有些研究也认为长期保存对精子会有一定程度的不利影响[25]。1.8保存条件用液氮蒸气代替液氮保存能够减少交叉污染的机会。因此有研究者建议将气相技术用于艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等携带者或患者的精子保存上。然而，在液氮气相贮存罐中，温度的梯度变化大，具体取决于容器的形状、容量和材料类型。并且应用气相贮存，需确保标本温度不低于-130℃否则易造成精子损伤。然而有研究关于精子在液氮及气态氮中保存对精子冻存效果的影响进行了比较，发现两种保存方式对冷冻精液的质量没有显著影响[26]。2.精液自身因素对冷冻复苏效果的影响精子冷冻复苏率的个体差异很大，而且同一个人不同批次的精液其冷冻复苏率也不尽相同。一般情况下，冷冻前精子质量越高，解冻后精子的活力会越好，因此精液常规参数可以作为预测精子冷冻复苏效果的重要指标。精液的自身因素包括：精子因素（精液常规参数、精子基因及蛋白）、精浆成分（还原型谷胱甘肽含量、ROS浓度、胆固醇及Ca离子的浓度）等等。2.1精子因素2.1.1精液常规参数评估精液质量的常规参数主要包括精子浓度、精子活力及形态正常精子百分率等等。使用冷冻前精液参数作为冷冻复苏后精子活力的预测指标的可靠性意见仍不一致，一些研究表明，冷冻前的精子活力与精子冷冻复苏率相关[27]；另有一些研究表明使用冷冻前参数很难预测精子复苏率。但大多数支持前者，尤其是精子正常形态与冷冻复苏率具有更高的相关性。YogevL等研究发现射精后1h及4h精子活动力是预测精子耐冻性最好的指标[28]。此外，形态异常的精子与正常形态的精子相比，在经过冷冻后更容易引起DNA损伤[29]。2.1.2精子细胞凋亡关于精子细胞的凋亡对冷冻复苏效果的影响，Said等对10例健康志愿者的精液通过磁性分离（MACS）技术进行处理，从而筛选到凋亡率低的精子，通过MACS技术筛选后的精子进行冷冻复苏后，冷冻复苏率明显高于未经MACS技术筛选的精子,因此，他们认为筛选过的细胞凋亡率低的精子更易在冷冻复苏技术中保存更久且获得更大的受精率。[30]。2.1.3精子的基因人类精液冷冻技术在有些精液标本中应用得很成功，但在有些精液标本中却存在一些问题，冷冻复苏后精子活力低。现在，有越来越多的证据表明精子对冷冻复苏过程的耐受性存在着个体差异，如：有些人或者动物的精液在冷冻前各项参数都很好，但冷冻复苏后精子的活力及存活率却很低。而且无精症及弱精症患者的精子基因调研显示有基因异常。因此寻找个体的基因差异能给精液冷冻保存提供基因基础指导。2.1.4精子的蛋白热休克蛋白(HSP)又称应激蛋白，是细胞应激反应的生物标志，也是细胞的内源性保护蛋白，发挥着分子伴侣的作用。研究发现，在精子冷冻复苏过程中，精子受到有害因素的刺激，HSP将对精子的冷冻损伤有一定的保护作用。HSP90在公羊精子冷冻复苏过程中，就对精子冷冻损伤具有保护作用，HSP90含量也因此可用于预测公羊精子的耐冻能力[31]。2.2精浆因素2.2.1活性氧精子获能及精子的顶体反应都需要活性氧（ROS）的存在，有研究表明缺乏ROS的冷冻精液的精子活力比含有ROS的冷冻精液的精子活力低，精子形态异常率更高，即认为精子冷冻复苏后的活动力与精液中SOD含量呈正相关。2.2.2Ca离子及胆固醇在精子获能的诸多影响因素中，细胞内Ca离子及胆固醇是最重要的因素之一。Mesequer等122份男性的精浆及精子细胞内的胆固醇及Ca离子浓度进行检测，发现胆固醇浓度与精子冷冻复苏率没关系，细胞内外的Ca离子平衡对精子冷冻复苏率有一定的影响[32]。2.2.3精浆置换人类精液中的精浆对精子的冷冻损伤具有一定的保护作用，精子的耐冻性可能与精浆成份有关，有研究认为，在对不育患者的精液进行冷冻处理时，利用高冷冻复苏率的供者精浆置换原不育患者精液中的精浆可能得到相对较好的冷冻复苏效果[18]。另外，还有研究发现通过添加精子耐冻性好的山羊精浆可以提高精子冷冻复苏率及冷冻复苏后IVF受精能力[33]。3.其他因素对精子冷冻复苏效果的影响3.1季节环境因素影响精液质量已有很多报道，尤其是季节变化对精液质量的影响报道较多。据统计，夏季精子浓度最低，春节及冬季精子浓度最高。然而环境因素对精子冷冻复苏率的影响报道极少。有研究对分别将来自高原地区的精液标本与来自居住于溪谷的精液标本进行冷冻保存并复苏后测量冷冻精子的存活率和形态完整性，发现来自高原地区的冷冻精子活率和形态完整性方面都优于居住于溪谷的冷冻精液标本。另有研究认为精液冷冻复苏效果受到季节因素的影响，在春季与冬季，精子的冷冻复苏效果更好，这可能与这两个季节精子的活力与精子核的成熟度更高有关。YogevL等对供精者捐献的精液研究发现精液的耐冻性从3月至9