纤维素柱填料的制备及其在

纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用（武汉大学化学与分子科学学院，武汉430072）摘要：本实验采用由一种廉价易得的纤维素，通过溶解和搅拌，制得尺寸排阻色谱的填料，并由此种填料分离猪血中的超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，）,并采用邻苯三酚的自氧化来测酶的活性。关键词：体积排阻色谱，梯度洗脱，纤维素填料，超氧化物歧化酶0引言超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，）,它广泛存在于各类生物体内。按其所含金属离子的不同分为3种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。，它是一种重要的自由基清除剂，能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O2-而保护细胞，能治疗多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在猪血液里，Cu.Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球。在一系列萃取和离心后，过DE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化，得到较纯的SOD。1实验部分1.1实验仪器与试剂1．试剂20%NaOH,SPAN-80，短线绒，4%硫酸，95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O,K2HPO4,0.9%NaCl,丙酮，10mmol/LHCl,邻苯三酚（用10mmol/LHCl作溶剂配制，4℃下保存），新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液，三羟甲基氨基甲烷（Tris-）。2.仪器烧杯（250mL、500mL、50mL各2个，800mL一个），量筒（50mL、100mL）,1000mL分液漏斗（1个），药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各2个），玻璃搅拌棒，恒流泵（1），自动部分收集器（1），淋洗液瓶（2），电磁搅拌器（1），微量进样器（25μL）,玻璃色谱柱（1.5×20cm），试管100支（5ml），台秤（2），机械水泵（1），真空干燥器（1），电炉（1），注射器及针头，回收瓶。紫外分光光度计（UV），荧光光度计，分析天平，低温高速离心机。2实验步骤1.纤维素柱填料的制备①将14gNaOH,24g尿素溶于162g蒸馏水中配制7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液200ml；②将上述溶液置于冰箱中冷冻至-12.3℃；③将冷冻好的溶剂取出，加8.4g棉短绒浆，室温下快速机械搅拌几分钟，纤维素即完全溶解。将其置于冰箱中待用；④准确称取3gSpan-80加入300ml的液体石蜡中，完全溶解后，加入到烧瓶中，以400r/min搅拌30min；⑤用注射器向其中缓慢加入准备好的纤维素溶液100ml,在常温下乳化1h；⑥在水浴环境下，升温至45℃保持2h；⑦滴加10%的盐酸，酸化到pH值接近于7；⑧停止搅拌，静置分层。回收上层石蜡，下层纤维素微球用蒸馏水和乙醇多次洗涤备用。2.酶的制备（1）取新鲜猪血500mL（已予先加入50mL2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000rpm离心20min除去血浆，收集红细胞约250mL，加入等体积的0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅拌充分洗涤，3000rpm离心20min，弃去上清液（如此反复3次），收集洗净的红细胞放入800mL烧杯中，加250mL重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min以上，得溶血液500mL。（2）往溶血液中缓慢加入在4℃下预冷过的950/0的乙醇125mL（0、25倍体积），然后再缓缓加入在40C下预冷过的氯仿75mL（0.15倍体积），搅拌15min，室温下3000rpm离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330mL（留样2mL测酶活性），此即酶的粗提液。（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O（按43gK2HPO4·3H2O/100mL粗提取液的比例），转移到分液漏斗，振荡后静置分层（约15min）。收集上层乙醇-氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500rpm）25min，弃去沉淀，得上清夜约150mL（留样1.5mL测酶活性）。（4）向上一步所得上清夜加入0.75倍体积在4oC下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3500rpm离心20min,收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL重蒸水中（呈悬浮状），在4℃下，在250mL2.5mmolL-1pH7.6的磷酸钾缓冲液中透析，每隔0.5h换透析液一次，共换4-5次。透析内液如出现沉淀，需在室温下3500rpm离心，弃去沉淀，收集上清液7mL（留样0.5mL）。（5）纤维素柱层析：将实验1所得柱填料1#和2#按体积比1:1混合并填充玻璃色谱柱，柱体1.5×20cm，填装时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密，均匀。装好后，填料的上部用一个带有小孔的聚四氟乙烯塑料圆片覆盖填料，以保持胶床顶部平整，不受流入溶剂干扰。用2.5mmolL-1pH7.6的缓冲溶液作层析柱平衡液，用2.5mmolL-1(100mL)-200mmolL-1(100mL)pH7.6的磷酸钾缓冲溶液进行梯度洗脱。流速为40mLh-1，每管收集4mL，收约20管。以H2O为参比，在280nm处采用紫外吸收法测定每管的吸光度，绘制淋洗曲线。参考的洗脱曲线见附录。酶蛋白峰和酶活性峰重合。3.酶活性的测定（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1加入缓冲液，于25oC保温20min，然后加入预热的邻苯三酚（对照管用10mmo1/LHC1代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，在327nm处，每隔断30s，测吸光度一次，通过改变邻苯三酚的用量控制自氧化速率在0.070A/min。(2)SOD或酶粗提取液的活性测定﹡：按表2加样，测定方法同上。单位体积活力（U/mL）＝｛［0.07-样液速率］/0.070/50%｝×100%×反应液总体积×（样液稀释倍数/样液体积）总活力（U）＝单位体积活力（U/mL）×原液总体积﹡活力单位：在一定条件下，使每亳升反应液自氧化速度抑制50％的酶量定义为一个活力单位（（U）2.实验数据1.酶的最大吸收波长图一.波长对吸光度作图峰的编号波长/nmABS1597-0.0062564-0.0053542-0.0064528-0.0055501.5-0.0046470.5-0.0027447-0.00184130.0019393.50.00210358.50.007113370.006122730.30313590.5-0.00914557-0.00815530.5-0.00816518-0.00717499.5-0.00618455-0.00619430.5-0.00620408.5-0.00121384-0.001223510.001233320.00324249.50.208表一.各峰对应的吸光度由上面的数据可知，在12号峰，也就是在273nm的时候吸收波长最大。因此，在后面的测量中应采用这个波长来对淋洗曲线进行测绘。2.淋洗曲线由淋洗曲线可知，最高处在编号15的样品中，所以在后面的自氧化速率的测量中采用15号测量。3.，酶的自氧化速率的测量0501001502002503000.000.050.100.150.200.250.30ABSTime/s1234图三.不同体系的吸光度对时间作图编号体系自氧化速率单位体积活力（U/ml）总活力U1邻苯三酚9.93939*10-4002邻苯三酚+15号酶9.27778*10-426958.6107834.43邻苯三酚+粗酶4.99048*10-4201653.14邻苯三酚+淋洗前溶液4.77143*10-4210578.73.实验结果的讨论1．在猪血液里，Cu.Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球。当红血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，而Cu.Zn-SOD则留在水-乙醇均相溶液中。将磷酸氢二钾加入水-乙醇均相溶液中时，由于其极易溶于水，而在乙醇中的溶解度甚低，溶液明显分层，上层是具有Cu.Zn-SOD的含水乙醇相，下层是溶有磷酸氢二钾的水相（比重大）。用分液漏斗分出上层具有SOD的含水乙醇相，再加入有机溶剂丙酮，使SOD沉淀。极性有机溶剂能导致蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。Cu.Zn-SOD的pI为4.95。将上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.6的条件下，Cu.Zn-SOD带负电，过DE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。2.在本次试验中，由于开始时没有及时的除去血块，还有制备好样液后没有及时的测量紫外的数据，可能由此导致了经过DE-32纤维素阴离子交换柱纯化后的酶活性并没有纯化之前的高。由此可知，SOD酶应该在合适的条件下，尽快测量，以期达到最准确的实验值。3.在制备纤维素填料时，很多因素都对填料的具体性质产生很大的影响，比如我们通过探究在加热和不加热的条件下，制得的纤维素球的大小的比较，了解到在其他条件相同的情况下，加热可以促进纤维素球的长大。还有很多因素都对纤维素球的粒径产生影响，比如Span-80加入的量，纤维素溶液的浓度，石蜡油的纯度，搅拌的速度，乳化的温度等等。。。。4.在开始时，由于邻苯三酚的浓度太高，所以在开始时无法体现酶的活性，在后来，将邻苯三酚的溶液稀释10倍后，才能体现酶的活性。5.在本次试验中，提取过的酶由于放置的时间过长，或因温度过高而使其部分失活，而未纯化的酶一直放在冰箱中保持了一个适宜的环境，其活性依然保持了一个较高的值，所以其活性不如未纯化前的酶的活性。4.结论本次试验通过一系列手段，从猪血中提取了超氧化物歧化（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，），并通过自氧化测得了酶的活性。致谢：感谢周金平老师的悉心指导，感谢同组同学的合作帮助，感谢预备室老师为我们提供各种仪器和试剂。参考文献[1]武汉大学化学与分子科学学院实验中心.综合化学实验（第1版）[M].武汉：武汉大学出版社，2003，39-50。PreparationandPurificationofSuperoxideDismutaseofCelluloseColumnPacking(CollegeofChemistryandmolecularsciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)Abstract:Forthepreparationofalower-cost,highlydistinguishedandgoodphsicalperformanceofthenewsizeexclusionchromatography,andbytheseparationandpurificationofSOD.Andthenunderstandtheproteinprecipitationoforganicreagents,andgradientelutioncolumnchromatography.First，puretheSODinpigblood,andthenusePEG-2000andcellulosecuprammoniumsolutionblendingmethodbycolumnchromatographytoclassifytheenzyme.Keywords:SOD、cellulosewadding、sizeexclusionchromatography、gradientelution