转基因动物与动物生物反应器

第9章转基因动物与动物生物反应器TransgenicAnimal＆AnimalBioreactor学习须知•主要内容：动物转基因技术及其应用•重点：常用的转基因动物培育技术章节内容•前言•9.1转基因动物的培育技术•9.2转基因动物的应用•9.3动物乳腺生物反应器转基因动物TransgenicAnimal前言在基因组内稳定地整合了以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。•或者是指借助基因工程技术把外源基因导入受体动物的染色体内，外源基因可在受体内稳定遗传的动物。转基因动物的研究历史：•1974年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。•1981年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠。•1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶，含量高达30毫克/升。•1989年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。•1997年10月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出3只携带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。•1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。9.1转基因动物的培育技术•常用的转基因动物培育技术有：•9.1.1基因显微注射法•9.1.2逆转录病毒感染法•9.1.3胚胎干细胞介入法•9.1.4精子载体导入法•9.1.5YAC介导法•9.1.6细胞核移植技术9.1.1基因显微注射法•原理•通过显微注射仪把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因组DNA中，获得转基因动物。9.1.1基因显微注射法•以转基因小鼠的培育为例：•1.目的基因的制备与纯化；•2.卵供体母鼠和假孕母鼠的准备；•3.供体母鼠超数排卵处理；•4.供体母鼠与公鼠交配；•5.受精卵采集；•6.目的基因显微注射；•7.受精卵移植；•8.目的基因表达鉴定和检测；•9.建立遗传基因小鼠近交系。1.目的基因的制备与纯化；•目的基因的来源：•内切酶的酶切片段；•cDNA;•人工合成基因片段；•PCR扩增特异片段。2.卵供体母鼠和假孕母鼠的准备；•将输精管结扎后绝育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠产生一系列一系列妊娠变化反应而得到假孕母鼠，做为受精卵转基因后的养母。3.供体母鼠超数排卵处理；•向可育雌鼠注射孕马血清取绒毛膜促性腺激素（PMSG）以及人绒毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。4.供体母鼠与公鼠交配；•超排卵处理后，供体母鼠与可育雄鼠交配。5.受精卵采集；•交配次日，剖腹从供体母鼠的输卵管内收集受精卵，CO2培养箱内培养液保存备用。6.目的基因显微注射；•用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内。显微注射的机理•受精卵1个小时之内，精子与卵子各自形成自己的原核，不融合，随着时间的推移，雄原核开始膨大。•注射针要插入雄原核内。首先将受精卵置于培养基的液滴内，用吸持针找到受精卵并吸持住，调整雄原核的位置。将注射针装好DNA溶液，通过调节注射管，慢慢将DNA溶液注射进入雄原核内。7.受精卵移植•将已转入基因的受精卵先体外培育，从单细胞到桑葚胚阶段，自假孕母鼠的背部植入其输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟。8.目的基因表达鉴定和检测•①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交（southern），鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍体动物的其中一条染色体上）；•②检测：通过northern(RNA)andwestern(Pr)杂交在转录和蛋白质水平上检测表达。9.建立遗传基因小鼠近交系。•首建鼠(半合子)与正常的野生型小鼠杂交，检测后代的整合率，取后代有50%机率带有整合基因的小鼠(阳性)，近亲繁殖，再通过同一窝的阳性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重组作用下，最终得到纯合子小鼠。转基因动物的一般制备过程转基因动物的一般制备过程（续）转基因动物的一般制备过程•显微注射法优点：•外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可100Kb。它可以直接获得纯系，实验周期短。•显微注射法不足点：•外源基因整合的效率低，不能控制整合的位点，外源基因随机结合或随机插入位点，有插入突变的风险，而且整合的拷贝数未知，方法较复杂，技术性强，设备昂贵等，基因稳定耗时较长，效率低。9.1.2逆转录病毒感染法•1.原理：•将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。2.流程•（1）构建逆转录病毒载体；•（2）包装细胞；•（3）重组病毒感染早期胚胎；（1）构建逆转录病毒载体•步骤：•病毒DNA提取；•病毒DNA克隆到载体；•外源目的基因克隆到载体。（2）包装细胞•包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA。•载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞内）。（3）重组病毒感染早期胚胎；•程序：•取出受精卵；•去除卵外的透明带；•包装细胞（含重组病毒）与受精卵共培养(转染)；•转染后的胚胎移植到假孕母鼠体内；•转基因仔鼠的筛选鉴定逆转录病毒感染法的优缺点•优点：•感染效率高；•缺点：•被导入的外源基因大小受限；感染后引起的安全性存在不确定性。9.1.3胚胎干细胞介导法•1.原理•外源DNA导入体外培养的ES细胞，把转基因的ES细胞注入受体囊胚并使其分化，再将此囊胚移植到假孕动物体内，产生子代，子代再经过全同胞兄妹交配，获得转基因纯合体。流程•分离培养ES细胞；•外源基因导入ES细胞；•囊胚期胚胎获得；•通过显微操作，把ES细胞注射到胚胎的囊胚腔，形成嵌合体；•转基因胚胎移植到假孕母鼠体内；•产生转基因小鼠。胚胎干细胞介导法的优缺点•优点：•在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择特殊的基因型；用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。•缺点：•许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因。9.1.4精子载体导入法•1.原理：•将成熟的精子与外源DNA进行预培养之后，使携带外源DNA的精子与卵子结合为受精卵，并使外源DNA整合于合子的染色体中。•2.精子携带DNA主要是通过三种途径来完成，即将外源DNA与精子共孵育、电穿孔导入法和脂质体传染法程序•外源基因导入精子；•转基因精子与卵子结合（通过人工受精，体外受精等）；•受精卵移植到假孕动物体内，产生子代，子代再经过全同胞兄妹交配，获得转基因纯合体。精子介导方法的优缺点•优点：•方法简单、方便，成本小，依靠生理受精过程，免去了原核的损伤。•缺点：•成功率不高,效果不稳定。9.1.5酵母人工染色体(YAC)介导法•ES细胞转染YAC后体外筛选，所得阳性ES细胞囊胚腔注射；•YAC的原核显微注射两种途径。•利用YAC转基因动物研究的优势在于保证巨大基因的完整性及所有顺式因子的完整并与结构基因的位置关系不变，且较大的外源基因片段在转基因动物研究时整合率提高，便于研究。9.1.6细胞核移植技术•1.原理•转基因技术与核移植技术结合。2.程序•外源基因转染动物细胞；•筛选整合有外源基因的体细胞作为核供体；•转基因供体核移植到去核卵母细胞；•被激活的转基因卵母细胞体外培养至囊胚；•囊胚移植到假孕母体，产生转基因幼子。3.该技术的优缺点•优点：后代全为转基因个体，遗传背景和遗传稳定性一致；仅需一代即可建立转基因群体，节约时间和物力。•缺点：•技术不够完善，成功率低；后代可能出现老化现象。9.2转基因动物的应用•2.1在基础理论方面的应用2.1.1可以对基因的结构和功能进行研究2.1.2可以进行组织表达特异性研究2.1.3还可以研究发育过程的特异性表达。将不同的外源基因转入宿主动物受精卵或早期胚胎干细胞，可观察研究目的基因在胚胎不同发育阶段的特异性表达、闭关及调控机理。•2.2在畜牧兽医中的应用2.2.1应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制.2.2.2应用于动物生产通过转基因技术，可以促进动物生长、提高畜产品产量、改善品质。•2.3在医学领域中的应用2.3.l建立诊断和治疗人类疾病的动物模型。目前，遗传学家可以通过精确地失活某些基因或增强某些基因的表达来制作各种各样的研究人类疾病的动物模型，也可以为研究诸如AIDS这样的疾病提供合适的动物模型。2.3.2用于生产药用蛋白目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注。2.3.3生产可用于人体器官移植的动物器官2.3.4借助转基因动物模型开展人类疾病的基因治疗。9.2.7转基因的应用存在的问题及展望•3.l转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。3.2难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。3.3难以全面掌握基因的表达和所受的调控。不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。3.4制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。3.5对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。外源基因整合方式•基因随机插入；•基因剔除；•基因替换；•后二者合称基因打靶。基因随机插入•外源基因插入时,需要限制性核酸内切酶去切宿主的基因,而限制性核酸内切酶可以识别特定的核酸序列并在特定的位点切开,而宿主的基因里又不止一段这样的核酸序列,所以会切出多个切段出来,所以是随机的。基因剔除•（geneknock-out），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。基因敲除的基本程序•打靶载体的构建•打靶载体导入ES细胞：重组置换•基因敲除ES细胞注射入胚泡•胚泡植入假孕小鼠的子宫中•嵌合体的杂交育种基因替换（基因敲入）•（geneknockin）是利用基因同源重组，将有功能的外源基因（基因组原先不存在、或已失活的基因），转入受体细胞，与基因组中的同源序列进行同源重组，进而插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。9.3动物乳腺生物反应器•将所需目的基因构建入载体，加上适当的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要药用蛋白。•生物反应器：目的基因可在器官组织中表达的转基因生物。•按照器官分为：乳腺，膀胱，血液等生物反应器。9.3.1动物乳腺生物反应器的制备•1.构建表达载体；•2.选择目的基因；•3.重组基因构建；•4.重组基因转导受精卵；•5.转基因胚胎移植；•6.转基因子代母畜及乳腺分泌物的鉴定。9.3.2动物乳腺生物反应器的优点•1.产品质量稳定；•2.成本低；•3.研发周期短；•4.环保，无污染；•5.效益高9.3.3动物乳腺生物反应器的应用•1.改良奶源品质目前，已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。2003年，Br