第4章酶1

第四章酶前言：酶的发展简史收麦装坛，发酵，成酒古埃及人用麦粉发酵制酒神奇转化力量？发酵产生酒精磨粉二十世纪初，有机化学发展后，才得知是酵母菌中的某种物质，在进行着糖类的转化反应；后来分析得到是一种蛋白质。1926年，Sumner首先结晶出尿素酶(urease)，并证实脲酶为蛋白质。绝大多数酶为蛋白质。第1节酶的基本性质一、什么是酶？酶（enzyme）是活细胞产生的对特异底物起高效催化作用的生物分子，是机体内各种代谢反应最主要的催化剂。所以又称为生物催化剂Biocatalysts。二、酶和一般催化剂的共性1，用量少而催化效率高；2，它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡点。3，酶本身反应前后无变化。作用的机理都是降低反应的活化能酶可降低所催化反应的活化能SPESESTEPST反应进行方向反应能量变化无酶时所需活化能有酶时所需能量较低低T=Transitionstate三、酶的特性1酶易失活-反应条件温和高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。2、高效性又称为酶的专一性（Specificity）、特异性，是指酶在催化反应时对底物的选择性。4.酶活力可调节控制如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。3．选择性五酶的组成（一）酶的蛋白质本质（核酶除外）（二）酶的组成根据酶的化学组成成分，可分单纯酶和结合酶两类。单纯酶(simpleenzyme)：除蛋白外不含其它成分。如脲酶、蛋白酶等。结合酶：除酶蛋白外，还需要其它化学成分参与酶才有活性。这些成分叫做辅助因子。Apo-enzyme脱辅酶輔辅基：共价键结合，透析不能去除辅酶：结合松弛全酶金属维生素Holoenzyme结合酶(conjugatedenzyme)辅酶的作用体内酶的种类很多，而辅酶(基)的种类却较少，通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合，但一种辅酶往往能与不同的酶蛋白结合构成许多种特异性酶。一般来说，辅酶决定了酶催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。（三）酶的活性部位酶分子很大，其催化作用往往并不需要整个分子。即某些酶的催化活性仅与其分子的一小部分（活性部位）有关。酶分子中与酶的活性直接相关的区域为酶的活性中心。是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。结合酶的辅助因子是活性中心的组成部分。酶分子中与底物结合的部位为结合部位。决定底物的专一性；酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。决定反应的类型。活性中心的结构特点：由结合部位和催化部位组成糜蛋白酶活性中心的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链，通过折叠后而在空间结构上相互靠近。六核酶（ribozyme)具有催化活性的RNA。注意：与核酸酶（化学本质蛋白质）不同！Ribozyme的发现：CechT.R于1982年提出的。①1981年，发现四膜虫的26SrRNA前体在成熟过程中，内含子在没有任何蛋白酶的情况下被剪接。②1985年，证明前体中的内含子L19RNA具有多种催化功能，将这种具有催化活性的RNA称为Ribozyme。获得1989年诺贝尔化学奖。四膜虫rRNA成熟中RNA的剪接示意图第二节酶的分类及命名一、酶的分类按国际酶学委员会(I.E.C)规定，按酶促反应的性质，可把酶分成六大类：(1)氧化-还原酶oxido-reductase催化氧化-还原反应。电子或质子转移。根据反应是否有O2直接参与反应，又分为脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(2)转移酶Transferase催化基团转移反应的酶。即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO(3)水解酶hydrolase催化底物加水反应的酶。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH(4)裂合酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。A-BA+B主要包括醛缩酶、水合酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(5)异构酶Isomerase催化各种同分异构体的相互转化，即分子内基团的重排过程。例如，葡萄糖异构酶催化的反应。OCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH果脯糖浆的生产原理合成酶，又称为连接酶，消耗ATP，由两种物质合成一种新物质（单键相连）。A+B+ATP===A－B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。CH3CCOOH+CO2＋ATPCOOHCH2CCOOHOO(6)合成酶LigaseorSynthetase2.酶的命名(1)习惯命名法:1,底物＋酶，如淀粉酶，蛋白酶有时：来源＋底物＋酶，如胃蛋白酶2,反应性质＋酶：水解酶、转移酶3，底物＋反应性质＋酶：琥珀酸脱氢酶习惯命名法简单，应用历史长，但缺乏系统性，有时出现一酶数名或一名数酶的现象。(2)系统命名法及编号鉴于新酶的不断发展和过去文献中对酶命名的混乱，1961年，国际酶学委员会规定了一套系统的命名法，使一种酶只有一种名称。它包括酶的系统命名和4个数字分类的酶编号。国际系统命名法及编号系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。如：丙氨酸+-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶编号：E.C2.6.1.2国际酶学委员会类亚类亚亚类亚亚类中的排号含N基团氨基第三节酶反应动力学酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。注意：速度指反应的初速度V0；研究某一因素对酶促反应速度的影响时，应该维持反应中其它因素不变。一化学动力学基础二、酶促反应动力学1902，Henri(Brown)水解蔗糖实验发现（酶浓度定）：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。随底物浓度增加，呈混合级反应；当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），表现为零级反应。02468101214161820020406080100ConcentrationofSubstrate(umol/L)RateofReaction(v)zeroorder1storder工作方式：中间产物学说(Henri和Wurtz)ES+P+SteadyStateTheory在反应的大部分时间内，[ES]复合物的生成速率和分解速率相等。[ES]的浓度为定值（图4-3）。SEE一）米氏方程ES的生成速率:K1[E][S]ES的分解速率:（K2+K3）[ES]根据稳态理论，两者相等。酶有两种存在方式：自由形式和工作形式即[E]=[E]t-[ES](vo)E+SESE+Pk2k1k3K1（[E]t-[ES]）[S]＝（K2+K3）[ES]移项，得ES的表达式：令[ES]=[E]t[S]Km+[S](vo)E+SESE+Pk2k1k3因为酶反应速率vo与[ES]成正比，即：vo＝k3[ES]米氏方程vo=Vmax[S]Km+[S](vo)E+SESE+Pk2k1k3vo=k3[ES]=k3[E]t[S]Km+[S]所有的酶都被底物饱和时，即［E]t=［ES]，反应速率达到最大，vmax＝k3[ES]=k3[E]t二）米氏常数的涵义Km即为米氏常数Vmax为最大反应速度当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。vo=Vmax[S]Km+[S]Km=[S]①Km是酶的一个重要的特征常数。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。它只与酶的性质有关，与酶浓度无关，但与测定条件如温度和pH有关。酶对每个作用底物都有Km值。三）米氏常数的意义Km:AffinitywithSubstrateS2S1S3S1S2S3Vmax1/2WhenusingdifferentsubstrateAffinitychangesKm1/Km：可近似表示酶对底物亲和力的大小。Km小，1/Km大亲和力大。②Km值可以判断酶的专一性和天然底物。有的酶可作用于几种底物，因此有几个Km值，Km值最小的为最适底物或天然底物。可判断酶的专一性。Km:Hexokinase的例子Glucose+ATP→Glc-6-P+ADP123456GlucoseAlloseMannose底物碳号Km=88,0005mMCHOH-C-OHHO-C-HH-C-OHH-C-OHH2-C-OHCHOH-C-OHH-C-OHH-C-OHH-C-OHH2-C-OHCHOHO-C-HHO-C-HH-C-OHH-C-OHH2-C-OH四）米氏常数的双倒数求法1Km11=+V0Vmax[S]Vmaxvo=Vmax[S]Km+[S]五）pH的影响在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。pH影响酶活性中心、辅酶及底物的解离状态，进而影响结合及催化。体内多数酶的最适pH为7。六）温度的影响一方面温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。不是酶的特征常数。102030405060708090020406080100TemperatureOCRelativeActivity(%)酶浓度反应速度V=K[E]条件：（1）温度：固定（2）pH值：固定（3）底物浓度酶浓度补充：酶浓度对酶促反应速度的影响E1E2E3二、酶活性（97）1）酶活力：又称为酶活性，即催化某一化学反应的能力。常以在一定条件下所催化的反应速度（单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量）来表示。单位：浓度/时间SPEt酶量要适中生成物要易测底物过量反应时间恰当10xKm酸碱度温度vo=[P]t■酶活性的测定：最适条件反应时间(min)生成物[P]010203040斜率tanS→Pmmolvo=[P]/tUnit=tmmol/minyxyx=vo酶的活力单位U2）酶活力单位：一般用活力单位U(Unit)表示，一般在最佳条件下进行。3）比活力：是指单位酶制剂所含有的酶活力单位数。4)总活力：反应体系中添加的所有酶的活力单位数。即该反应能达到的Vmax。5）回收率：纯化后和纯化前总活力的比值。6）纯化倍数：指提纯后与提纯前比活力的比值。例：1g淀粉酶制剂，用水溶解成1000mL，从中取1mL测定淀粉酶活力，测知5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂所含的淀粉酶活力单位数。（淀粉酶活力单位定义：在最适合条件下每小时分解1g淀粉所需要的酶量为1U）。0.25/5*60*1000五）转换数Kcat和Kcat/Km（102）Kcat：当酶被底物饱和时，每mol的酶在单位时间内催化底物转化成产物的mol数。Kcat=总活力/酶用量=Vmax/[E]tKcat反映的是大量底物下酶被饱和时的性质。低[S]时失去意义。六）Kcat/Km：用来比较酶催化效率最好的参数。例：1ug纯酶（Mr92000）在最适条件下，催化反应速率为0.5umol/min。以1umol/min为1U。试计算（1）酶的比活力；（2）转换数。(1)0.5U/ug酶;500U/mg酶500/(10-3/92000)=500*92000*1000=4.6*1010U/mol酶(2)由于U=umol/min4.6*1010U/mol酶=4.6*1010umol/min/mol