微管实验protocol中文版

TubulinPolymerizationAssayKit(Cytoskeleton-Cat.#BK011P)一、微管体外聚合实验分为3个时相，成核期、生长期、平台期。Paclitaxel会消除成核期并增加生长期的Vmax，而Nocodazole则导致Vmax减少和聚合量减少。微管蛋白(tubulin)由55kDa的αβ微管蛋白组成，真核中保守，故采用猪脑提取。tubulin聚合时先形成proto-filaments再形成microtubules。Tubulin体外能从2端聚合但体内聚合速度不同，快速聚合端称plus-end位于微观组织中心；慢速端称minus-end。二、试剂盒组成组分描述Buffer1.(Part.#BP01)2管，干粉，每管加10mL超纯水配成1×buffer，包括80mMPIPES，2mMMgCl2，0.5mMEGTA，pH6.9，10M荧光报告基团GTPstock(Cat.#BST06-001)3管，干粉，每管加入100L灭菌水配成100mMstocksolutionTubulin蛋白.(Cat.#T240-DX)含有10mg冻干微管蛋白，从猪脑纯化，99%纯度，白色粉末TubulinGlycerolBuffer(Cat.#BST05-001)1管，10mL，包括80mMPIPES，2mMMgCl2，0.5mMEGTA，60%甘油，pH6.9Paclitaxel.(Cat.#TXD01)1管，干粉，加入100LDMSO配成2mM母液DMSO1管，1mL，配制Paclitaxel用Halfarea96wellplate1块，黑，平底，CorningCostarCat.#3686三、试剂盒重构（-80度保存6个月）1、Buffer1（Part#BP01）：每管加10ml超纯水，2管混匀，13×1.5mL/管分装（2mLEP管）2、GTPStock（Cat.#BST06-001）：每管加100l灭菌水，3管混匀，13×20L/管分装（0.5mLEP管）3、Tubulin蛋白（Cat.#T240-DX）：a、将12个标有“tubulinstock,10mg/mL”的冻存管置于冰上预冷b、20L（1管）100mMGTPstock冰上解冻，将15L的100mMGTPstock与1.5mL（1管）冰预冷的Buffer1混匀，取1.1mL的Buffer1（含GTP）重悬Tubulin粉末，冰上放置2分钟以彻底重悬c、12×88L分装，于液氮中瞬间冷冻(dropfreeze)后，于-80度保存，每管可用于6-8个assay4、Paclitaxel（Cat.#TXD01）：加入100L的DMSO5、TubulinGlycerolBuffer（CushionBuffer）（Cat.#BST06-001）：无需重构，4度保存四、使用步骤1、仪器设置为动态读值，1分钟1读共60分钟（有时可缩为30分钟），激发波长360nm/发射波长450nm，当scale最大值为120时gain设为80，每孔读值3次，integration设置为0-40s，振动设为5s（Medium,orbital-firstreadonly?），板子使用CorningCostar96-wellplate(CorningCostar,Cat.#3686)。将100L的10倍稀释的buffer1加入每孔中并激活NewTemplateScanProcedure。2、将96孔板(CorningCostar,Cat.#3686)置于酶标仪中，37度预热10分钟。3、将paclitaxel母液解冻，5l加入325L灭菌水，得30Mpaclitaxel（10×母液），使用前置室温。4、化合物配成2mM母液再水中稀释成10×母液,10mM化合物1：100至水再1：10至测活体系成10mM。5、直到化合物准备好了再开始下面的实验。6、1.5mL（1管）的Buffer1解冻后置于冰上。7、20L（1管）的GTPstock解冻后置于冰上。8、将TubulinGlycerolBuffer从4度取出置于冰上。9、88L（1管）tubulin(880g，即10mg/mL)在室温水浴中迅速解冻后置于冰上以免微管聚合。10、速将Buffer1、TubulinGlycerolBuffer、GTPstock、TubulinStock按下表制成反应液，冰上可放1h。Component共444.4l可用于8个孔StandardConditionsInhibitorDetectionEnhancerDetectionFinalConcentrationBuffer1243L205L(71管)355L1×TubulinGlycerolBuffer112L150LNoneVariesGTPstock(100mM)4.4L4.4L(41管)4.4L1mMTubulinstock(10mg/mL)85L85L(1管)85L2mg/mL11、两副孔，5L对照buffer（与溶解化合物的buffer一致）加入A1&B1，5l的10×paclitaxel加入C1&D1，5l的10×测试的化合物加入E1&F1，直到所有化合物加完。12、将加有1l化合物的板子放于酶标仪预热1分钟（不得超过1分钟以免蒸干）。13、96孔板每孔加入50l的反应液，要快且使用适当速度贴孔壁排液以避免产生气泡。14、立刻读数，如果开始后5分钟内出错可重新读数。五、注意事项注1：10×inhibitor阳性对照：5L的5mM氯化钙溶液或30MNocodazole/vinblastine（长春碱）/colchicine（秋水仙素）；10×enhancer阳性对照：30MPaclitaxel，kit中初始浓度为2mM。注2：8个孔内可单道加，1分钟加完；超过8个孔需排枪加；适中快速且贴着孔壁较低的位置排液，避免产生气泡，可用2mg/mL的BSA蛋白溶液练习。注3：标准的反应体系包括2mg/mL微管，80mMPIPESpH6.9，2.0mMMgCl2，0.5mMEGTA，1.0mMGTP和15%甘油。要优化对inhibitor的检测采用20%甘油，检测enhancer则采用15%甘油。注4：微管必须放冰上直到加入96孔板assay，在加入微管前预热96孔板。注5：微管要在分装前在液氮中速冻后再置于-80度干燥保存；且冻存前微管蛋白浓度要大于6mg/mL。注6：测活标准条件是2mg/mL微管+1mMGTP+15%甘油的Buffer1。促进解聚采用更高浓度微管蛋白产生高信号；促进聚合不用/用低浓度甘油有助于检测，如不加甘油微管不会聚合而paclitaxel则会促进聚合。如果要找通过结合微管疏水口袋而促进微管解聚化合物则可不加甘油并增加微管含量或者使用MAPs（不是通过与微管疏水口袋结合而是通过离子性结合）。注7：1个单位的微管(100g，55L）加入1个孔，于30分钟后达最大荧光值(强度增3~4倍)。六、Troubleshooting技术支持：[e-mail]问题解决方案没有聚合1）340-360nm(激发)，410-460nm(发射)2）动态读值，30s~1min读一次数值波动1）所有步骤严格遵守，CV值在11%2）需要GTP的buffer冰上放置时间不超过4h，超过4h后丢弃，不可重复使用实验间的不一致的聚合结果1）微管蛋白失活，可能由不正确冻存导致；10mg/mL浓度微管于液氮中速冻且不可冻融使用；保存时蛋白浓度要高于6mg/mL；干粉受潮所致2）聚合时严格控制在37度，测活前96孔板预热至37度，若室温则微管成核时间加长3）甘油浓度对聚合影响很大，确保反应中含有甘油4）微管蛋白浓度对聚合影响很大，差的聚合反应可能是由于浓度低于2mg/mL对照聚合存在稳定的差异由于加蛋白慢导致先加的孔在最后的孔加完之前已开始聚合，这常常是超过8个样品而使用单通道移液枪所致1）加快加样2）多通道排枪加样聚合曲线波动气泡导致，小心加样避免气泡