第7次课天然产物生物转化1

生物转化在天然产物研究中的应用一、引言二、生物转化应用于甾体药物合成三、生物催化不对称合成一、引言生物转化是一种以生物工程方法，以微生物或酶进行的有机化学反应。例如，在非活性碳原子上引入羟基：醋酸化合物氢化可的松前体OCH2OAcOHO梨头酶28℃,48hOCH2OAcOHOHO再例：喜树碱10-羟基喜树碱在温和及中性条件下进行水解：青霉素青霉胺NNOOOOH黄曲霉素T-37NNOOOOHHONHNOSCOOCONH2NOSCOOCOO+青霉素酶青霉胺的左旋体具有治疗风湿的功能，而其右旋体有致特变的作用。又如：　OOCCCCOOHH天冬酶(aspartase)HOOCCOOHNH3NH4+NCH3CH3(H3C)2NNCH3CH3(H3C)2NOHNCH3CH3(H3C)2NOH多主枝黑心菌+锥丝碱9α-羟基锥丝碱12α-羟基锥丝碱再如生物转化在脱氢方面的应用，抗炎药物乙酸强的松可由乙酸可的松C-1,2位去氢制得，它的抗炎作用比乙酸可的松强3~4倍，副作用也小。以前用二氧化硒法脱氢，收率低，而采用简单节杆菌脱氢，收率高达85%左右。OOCH2OAcOOHOOCH2OAcOOH简单节杆菌乙酸可的松乙酸强的松应用酶法，反应可以在温和条件下进行，且收率高。由于生物转化在温和条件下进行，选择性高，立体专一性强，方法简便，故越来越受到有机化学家、微生物学家和药物化学家的重视。下面结合天然产物研究的一些实例作些阐述。二、生物转化应用于甾体药物合成1.甾体药物与甾醇生物转化(1)甾体药物甾体药物是制药工业中极为重要的产品，它包括性激素、避孕药、肾上腺皮质激素、同化激素等。例雄激素睾丸酮，雌激素炔雌醇甲醚，孕激素双酯炔诺酮，避孕药甲基炔诺酮，皮质激素氟烃氢化泼尼松，同化激素去氢甲睾酮等。OOH睾丸酮OHCCHH3CO炔雌醇甲醚OAcCCHAcO双酯炔诺酮OHCCHO甲基炔诺酮OFHOOCH2OHOHOH氟烃氢化泼尼松OHCH3O去氢甲睾酮1968年，全世界约70%的甾体药物是从墨西哥产的薯蓣皂素作起始原料进行生产。下图表示由薯蓣皂素及中间体ADD出发生产的甾体激素。HOOOOOOOH6步HOHO胆固醇β-谷甾醇发酵OOOOHCCH薯蓣皂素4-雄甾烯-3,17-二酮（4AD）睾丸酮1,4-雄甾二烯-3,17-二酮（ADD）妊娠素17α-乙炔基-17β-羟基-4-雄甾烯-3-酮OOHCCHOHCCHHOOHHOOHHOOH炔诺酮（避孕药）雌二醇乙炔雌二醇（雌性激素）雌三醇（更年期病药）HOO雌酮ADD近年来随着新甾体药物的发现，生产的发展，生产规模的扩大，原料需要量也逐年增加；另一方面由于不合理的采掘，造成资源逐年短缺，植物中皂苷含量下降，使在国际市场上供需间出现矛盾，薯蓣皂素的成本飞涨。日本及美国的一些学者着手进行扩大资源的研究。(2)甾醇生物转化自然界存在着极为丰富的甾族化合物，如胆固醇、β-谷甾醇等，其结构与甾体药物相近，利用这些甾体资源的关键是使C-17位侧链降解，并进行羟化、脱氢、芳构化等一些反应。大家都知道，以CrO3氧化，使侧链降解获得17-酮基化合物的方法，收率9%，无实用价值。国外一些学者用生物转化的方法，达到了C-17位侧链降解这一目的，并可在甾核结构上一些非活性部位发生羟化、脱氢、环氧化等反应，从而获得所需的甾体药物。例一些常见甾体资源：一般认为胆固醇经过体内生物转化，即在酶的作用下，使其侧链降解，并经过其它的一些转化而产生各种化合物，具体过程见下图所示。因此，人们预料也许微生物也具有各种酶能使侧链切断。HO芸苔甾醇(compesterol)HOH酵母甾醇(zymosterol)HOHO胆固醇(cholesterol)β-谷甾醇(β-sitosterol)HOOOOCOOHOCOOHOOOOADD胆固醇4AD睾丸酮OOHOOHOOHHHOOHHHOOHHADD的进一步分解：OOADDOOOHOOHOCOOHHOOOHOHOOCOOOHOOCCOOHCOOHHCH2CH3OCOOHO3-hydroxy-9,10-seco-androsta-1,3,5(10)-triene-9,17-dione琥珀酸+2.甾体侧链的选择性降解甾醇代谢过程中，希望某中间体累积，一般可采用诱变，使微生物失去进一步分解该中间体的能力；或加入酶抑制剂，使参与该反应的酶失活。(1)通过诱变技术选择性降解甾体侧链通过诱变技术得到选择性降解甾体侧链而不导致甾体母核破坏的生化阻断突变株。诱变一般是采用物理方法如紫外线照射，化学诱变剂如N-甲基-N’-亚硝基胍等。由诱变产生生化阻断的突变株中，由于酶的缺损，导致甾体降解不完全，使发酵液中能产生大量积累所需产物的中间体，如4AD、ADD等。(2)酶抑制剂存在下甾体侧链的选择性降解甾体化合物如胆固醇等的微生物降解历程是侧链端甲基的羟基化，羟基被氧化形成羧基，羧酸的β-氧化而导致碳链的缩短。当侧链断裂以后，发生9位羟基化，接着B环的开裂，再进一步分解而产生二氧化碳和水。所以9位羟基化是甾体母核分解的开始，若能抑制9位羟化酶，有可能使ADD积累，供进一步合成其它药物用。已知9位羟化酶是单一氧化酶，具有几个蛋白质并形成一个电子转移链，其中有的蛋白质是以Fe2+作为必需金属离子的蛋白质，除去或取代了这一金属离子就使酶完全丧失活力。因此常用金属螯合剂来除去Fe2+，或用性质相似而无活性的离子来取代Fe2+。金属螯合剂中必须具备Fe2+螯合能力及亲脂性，例如，α,α’-联吡啶、邻二氮杂菲及8-羟基喹啉的效果较好。乙二胺四乙酸(EDTA)螯合能力很强，但是在脂肪族分子中又带有负电荷，亲脂性差，不能抑制9-羟基化酶，使ADD积累。但是使用时同时加入表面活性剂，如月桂基硫酸钠或十六烷基三甲基铵溴化物，同样也能使ADD积累。NNNNNOHα,α'-联吡啶邻二氮杂菲8-羟基喹啉另发现Ni2+、Co2+等能抑制9位羟基化，Fe2+、Ni2+及Co2+离子半径分别为0.83A、0.78A、0.82A，十分接近，所以Ni2+、Co2+在9-羟基化反应中，与Fe2+交换而抑制9-羟化酶的活力而导致ADD的积累。(3)侧链降解实例周维善等曾从胆固醇乙酸酯和β-谷甾醇乙酸酯经三步化学反应制得19-羟基胆固醇乙酸酯和19-羟基-β-谷甾醇乙酸酯，将这两个化合物分别用分支杆菌-209-20转化，结果19-羟基胆固醇乙酸酯和19-羟基-β-谷甾醇乙酸酯的侧链被降解，得到产物19-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮，产率分别为67%和57%。19-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮可以作为合成19-去甲甾体药物的原料，而且这一步微生物转化可以在较高的底物浓度下进行。AcORAcORBrOHR=HR=C2H5乙酰胆固醇乙酰-β-谷甾醇AcORBrOHOH2CAcORHOOO分支杆菌19-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮OHO雌甾酮OO4-雌甾烯-3,17-酮H3.甾体生物转化的反应类型除了上述甾体侧链的降外，甾体生物转化的反应类型主要还有以下三类。(1)羟化反应羟化反应是最重要的微生物转化，专一性较强，其中以C-9α、C-11α、C-11β、C-16α、C-16β、C-17α、C-19角甲基和侧链C-27位上的羟基较为重要。羟基形成的机理可能为：转化到甾体上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢的位置，且取代过程中没有产生立体构型的变化，也不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型(α或β型)是由氢原子原来所占的空间位置决定的。C-11α、C-11β羟化的生物转化在抗炎药物的制备中经常用到，例由薯蓣皂素经开环、氧化、环氧化等生成中间产物16,17α-环氧黄体酮，用黑根霉在C-11α位上引入羟基，再经溴化氢开环脱溴，进行C-21碘置换，得抗炎药物乙酸可的松，见下图。此法工艺简便，总收率约34%左右。OCH3OO黑根霉OCH3OOHOOCH2OAcOOHO16,17α-环氧黄体酮乙酸可的松(2)脱氢反应微生物对甾体脱氢经常发生在A环的C-1,2和C-3,4位之间。抗炎甾体药物的母核在C-1,2位导入双键后，能成倍增加抗炎作用。例如乙酸可的松C-1,2位导入双键生成1,2-脱氢乙酸可的松后，抗炎作用增加3~4倍。化学方法脱氢一般用二氧化硒法，收率较低，且产品中硒不易除尽，所以生物转化脱氢较化学方法好。脱氢反应机理如下图所示，甾体C-1,2-脱氢是在酶与辅酶催化下先进行了酮的烯醇化，然后形成的烯醇化氢与酶结合而直接脱去氢。HOHHOHCoenzEnzOHCoenzEnzHO+EnzH+CoenzH下图为氢化可的松在简单节杆菌作用下，C-1,2位脱氢得氢化泼尼松（氢化强的松）的例子。氢化可的松浓度低时转化率可达95%，得到的氢化泼尼松再经乙酰化得乙酸氢化泼尼松，它的抗炎作用效率高、副作用小。OHOCH2OHOOHOHOCH2OHOOHOHOCH2OHOOH简单节杆菌乙酐吡啶氢化可的松氢化泼尼松乙酸氢化泼尼松(3)芳构化反应生物转化甾体时，芳构化主要发生在A环上，芳构化反应是合成雌激素的一类重要反应。芳构化酶是属于细胞色素P450的一种复合酶，可氧化脱去C19类固醇的19-甲基，使A环芳构化，从而转变成C18雌激素如雌酮、雌二醇等，过程如下所示。OOHOH2COOHOH2COOHOO雄甾烯二酮HCHO雌甾酮另外由于A环芳构化以后，甾核对微生物较稳定，设想可进行甾醇侧链的降解直接合成雌激素等药物。有人利用Nocardiasp.(ATCC19170)，成功地直接从19-羟基-4-胆甾烯-3-酮及19-羟基-4-谷甾烯-3-酮来制备雌甾酮：HOH2COHOO19-羟基-4-胆甾烯-3-酮雌甾酮HOH2CO19-羟基-4-谷甾烯-3-酮Nocardiasp.(ATCC19170)60年代有人利用14C标记的三种甾体化合物4-14C-4-雄甾烯-3,17-二酮、雌甾酮及雌二醇与微生物一起培养(见下图)，发现雌甾酮及雌二醇没有被分解，A环的芳香化使甾体环系稳定。1030507010010203040506070(h)雌甾酮，雌二醇雄甾烯二酮总14C残留(%)4.实例胆固醇用Arthroboctersimplex的发酵过程大致可分三步进行：(1)细胞生长；(2)加入胆固醇诱发分解胆固醇的酶；(3)加入螯合剂抑制9-羟基酶，使ADD积累。由于胆固醇、植物甾醇不溶于水，实际工作中，常将甾体化合物磨成细粉，并加入适量植物油及种子蛋白，使ADD的转化率大大提高。可由ADD以各种化学方法生产以下产品：雌激素：炔雌醇甲醚，雌二醇，雌三醇等。OHCCHH3CO炔雌醇甲醚OHHO雌二醇OHHOOH雌三醇雄激素：睾丸酮等利尿剂：螺甾内酯等皮质激素：氟烃氢化泼尼松等抗肿瘤药：1-dehydro-testololacton等OOHOSCH3OOOFHOOCH2OHOHOHOOO孕激素：炔诺酮，异炔诺酮，双酯炔诺酮等.炔诺酮异炔诺酮双酯炔诺酮OOHCCHOHCCHOOAcCCHAcO三、生物催化不对称合成天然产物大都有一个或数个手性中心，它们的合成，常常用不对称合成法引入手性中心；或者用化学拆分法将光学异构体分开而得到天然产品。如果先合成带双官能团的手性合成源，具有需要的手性中心，用适当的方法连接，有可能较容易地达到目的。这些带双官能团手性合成源可以借生物转化获得，主要的双官能团手性合成源有：XYHXYHOXYHXYHABCDXYHHHOYXYHHHHEFG例如，手性天然产物：α-生育酚、利福霉素(rifamycin)S、红诺霉素(erythronolide)A、calcimycin及monensin等，都具有多个手性中心，并可以分解成若干个带有手性中心的片段，即手性合成源。若能获得这些手性合成源，用适当方法联接，有可能进一步合成这些化合物，即可完成其全合成。YHOHYHOHYHOHHJIOCH3HOCH3CH3HHα-tocopherolOOOOHONHOHOAcMeOOOOHrifamycinSOOOHHOOOHOHOHerythronolideA手性合成子除通过化学合成的方法制备外，还