第7章分光光度法

1第7章分光光度法（约3万字编者：史建军）[内容简介]分光光度法是目前应用最为广泛的一种分子吸收光谱法，主要用于试样中微量组分的定量测定。本章着重介绍分光光度法的基本原理、分光光度计的主要部件和几种常见仪器的使用操作方法、可见分光光度法测定分析技术、目视比色法的原理和方法、分光光度法的实际应用等。[学习要求]通过对本章的学习，要重点掌握光吸收定律、影响显色反应的因素和测量条件的选择、仪器的基本构造及使用方法、掌握利用分光光度计对试样进行分析测定的技能。7.1概述许多物质都是有颜色的，例如KMnO4水溶液呈紫红色，K2Cr2O7水溶液呈橙色，Ni(NO3)2水溶液呈绿色，Cu2+在水中呈蓝色等。有些物质本身无色或是浅色，但当它们与某些试剂发生反应后，也可以生成有色物质，例如Fe3+与CNS–生成血红色配合物；Fe2+与1.10-邻菲罗啉（1,10-邻二氮菲）生成橙红色配合物；Cu2+与NH3生成深蓝色配合物等。这些有色物质溶液颜色的深浅与溶液的浓度有关，溶液的浓度愈大，颜色就愈深。浓度愈小，颜色就愈浅。因此，在分析中利用比较溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质含量的方法称为比色分析法。以人眼来检测溶液颜色深浅的方法称为目视比色法；以光电转换器来检测溶液颜色深浅的方法称为光电比色法。利用分光光度计测定溶液对某一波长光的吸收程度来分析被测物质含量的方法称为分光光度法。分光光度法不仅能在可见光区（400～780nm）测定有色物质的含量，还能在紫外（200～400nm）和红外光区（3000～40000nm）测定物质的含量和结构。所以，分光光度法又分为可见分光光度法、紫外分光光度法、红外分光光度法。本章仅着重讨论可见分光光度分析。分光光度法具有以下特点：（1）灵敏度高重量分析和容量分析一般只适应于常量组分（＞1％）的测定，不能测定微量组分（0.01％～1％）和痕量组分（＜0.01﹪），而分光光度法可测定浓度为10-5～10-6mol·L-1(达微克量级)的物质，相当于含量为0.001～0.0001﹪,甚至更低。如果将被测组分事先加以富集（采用萃取、共沉淀等方法），灵敏度还可以提高。非常适用于微量组分的测定。2（2）准确度较高分光光度分析一般相对误差为2﹪～5﹪，看起来它的准确度比重量分析法和容量分析法低得多，但对于微量组分的测定，已完全满足要求。在微量的情况下，重量分析法和容量分析法是无法进行准确测定。（3）操作简便，分析速度快分光光度法所使用的仪器设备并不复杂，操作也比较简单。试验溶液进行分析时，一般只经历显色和吸光度测定两个步骤，就可以得出分析结果。在生产过程的例行分析中，一般几分钟，甚至数十秒就可报出结果。（4）使用成本低仪器设备价格便宜，分析时所用的试剂数量较少，因而使用费用较低。（5）应用范围广几乎所有的无机物和许多有机物都可以直接或间接用此法进行分析测定。因此，在石油、化工、冶金、国防、刑侦、环保、食品、质检、科研等领域应用十分广泛。随着科学技术的迅猛发展，计算机技术在分析仪器制造中的广泛应用，各种新型智能分析仪器将不断出现，例如可自动计算、储存、分析数据，打印、显示反应浓度、酸度、时间、速度、温度与吸光度的关系等功能。使人们获得更多、更准确、更全面的信息。7.2光的吸收定律7.2.1朗伯-比尔定律7.2.1.1光的基本性质光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。光既是一种波，它具有波长（λ）、频率（ν）和光速（c），它们的关系是λ·ν=c（7-1）式中λ的单位为nm(纳米)；ν的单位为Hz（赫兹）；c为3×1010cm·s-1（真空中）光也是一种粒子，它具有能量（E）。它们的关系是E=hν=h·c(7-2)式中E为能量，单位是eV(电子伏特)；h为普朗克常数（6.627×10-34J·s）；ν为频率，单位是Hz；c为光速；λ为波长，单位是nm。3从式7-2可见，不同波长的光，能量不同，波长愈长，能量愈小，波长愈短，能量愈大。将电磁波（光）按波长或频率排列成图表，则该表称为电磁波谱。表7-1电磁波谱波谱名称波长范围频率/MHz光子能量/eV跃迁能级类型分析方法γ射线Χ射线远紫外线近紫外线可见光近红外线中红外线远红外线微波无线电波5×10-3～0.14nm10-2～10nm10～200nm200～380nm400～780nm0.75～2.5μm2.5～50μm50～1000μm0.1～100cm1～1000m6×1014～2×10123×1014～3×10103×1010～1.5×1091.5×109～7.5×1087.5×108～4.0×1084.0×108～1.2×1081.2×108～6.0×1066.0×106～105105～102102～0.12.5×106～8.3×1031.2×1061.2×102125～66～3.13.1～1.71.7～0.50.5～0.022×10-2～4×10-44×10-4～4×10-74×10-7～4×10-10核能级内层电子能级原子及分子的价电子或成键电子能级分子振动能级分子转动能级核自旋能级Χ射线光谱法真空紫外光谱法紫外分光度法可见分光光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核磁共振光谱法具有同一波长的光，称为单色光。纯单色光很难获得，激光的单色性虽然很好，但也只是接近于单色光。含有多种波长的光称为复合光，日光、白炽灯光等白光都是复合光。能被人肉眼感觉的光称为可见光，其波长范围是400～780nm。波长小于400nm的紫外光和波长大于780nm的红外光均不能被人的眼睛感觉，所以这些波长范围的光是看不到的。在可见光范围内，不同波段的光刺激人的眼睛后，会产生不同颜色的感觉。见表7-2。日光中的可见光（白光也是复合光）就是这些不同波段的色光混合而成的。把复合光分解成单色光的过程，叫光的色散。当一束白光通过棱镜后就会色散为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光。实验证明，不仅七色光可以混合成白光，其中的两种色光按一定强度混合也可以成为白光。这两种白光称为互补色光。图7-1中处于直线关系的两种色光为互补色光，例如橙色光和青蓝色光、绿色光和紫色光、黄色光和蓝色光都是互补色光。4表7-2各种色光的波长颜色波长紫色蓝色青色绿色黄色橙色红色400～450450～480480～500500～560560～590590～620620～760图7-1互补色光示意图7.2.1.2物质的颜色和对光的选择性吸收（1）物质的颜色如果把不同颜色的物体放在黑暗处，什么颜色也看不到。可见，物质的颜色与光有密切的关系，物质的颜色由光的组成和物质本身的结构共同决定。当白光照射到固体物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈黑色；如果完全反射，则呈白色；如果对各种波长的光均匀吸收，则呈灰色；如果选择吸收某些波长的光，则呈反射或透射光的颜色。溶液呈不同颜色是由溶液中的离子或分子对不同波长的光具有选择性吸收而引起的，溶液的颜色是它吸收光的互补光色。见表7-3。表7-3物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系青蓝青红蓝黄橙紫绿白光5当一束光（强度为I0）通过下列几种溶液时，溶液呈现的颜色和吸收光的关系见图7-2，(a)无色透明溶液(b)KMnO4溶液(d)K2CrO7溶液(e)Fe(CNS)3溶液（f）黑色溶液（g）均匀吸收溶液图7-2溶液呈现的颜色和吸收光的关系（2）物质吸收光谱曲线溶液对不同波长的光吸收程度并不相同，如果将不同波长的光依次通过某一固定浓度的溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度），以波长为横坐标、以吸光度为纵坐标作图，得到一曲线。曲线描述了物质对不同波长光的吸收能力，称为吸收光谱曲线。如图7-3所示。图7-3是三个不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线。从图上可以看出：①KMnO4溶液对不同波长光吸收程物质的颜色吸收光颜色波长黄绿黄橙红紫红紫蓝青蓝青紫蓝青蓝青绿黄绿黄橙红400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～600600～650650～760I0I0吸收绿光I0紫色光吸收青蓝I0橙色光I0吸收青光均匀吸收全部吸收I0I0红色光灰色光6度不同，对波长为525nm的绿色光吸收最多，在吸收曲线上形成一高峰（称为吸收峰），而对红光和紫光吸收很少，因此KMnO4溶液呈紫红色。光吸收程度最大处所对应的波长称为最大吸收波长（常以λmax表示）。在进行光度测定时，选定在λmax处测量，可以得到最大的灵敏度。②不同浓度的KMnO4溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收波长也相同，所不同的是吸收高峰随浓度的增加而增高。③不同物质溶液的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同。因此，可以利用吸收曲线作为定性、定量分析的依据。7.2.1.3朗伯-比耳定律（1）透射比和吸光度当一束光通量为Φ0的单色光垂直照射在含有吸光物质的均匀溶液时，一部分光被溶液吸收，透过溶液的光通量Φtr减少。其比值Φtr／Φ0表示溶液对光的透射程度，称为透射比（也称透光率），用符号τ表示。τ=0tr（7-3）可见透射比τ愈大说明溶液对光的透射程度愈大吸收愈小，反之τ愈小则溶液对光的透射程度愈小吸收愈大。τ用百分数表示，又称百分透射比。有色溶液对入射光的吸收程度称为吸光度（也称吸光率），用符号A表示,且A=lgtr0=lg1=－lgτ(7-4)(2)朗伯定律1768年朗伯（S.H.Lambert）研究了物质对光的吸收与吸光物质的厚度的关系，证明入射光强度一定、溶液浓度、温度一定时，溶液的吸光度与液层厚度（b）成正图7-3KMnO4溶液的吸收曲线1—C（KMO4）=1.56×10-4mol·L-12—C（KMO4）=3.12×10-4mol·L-13—C（KMO4）=4.68×10-4mol·L-17比，即A=k1b(7-5)式中k1为比例常数，它与入射光的波长、溶液的性质、浓度和温度有关。(3)比耳定律1859年，比耳（Beer）研究了不同浓度的溶液对光吸收的定律，证明当入射光的强度、溶液液层厚度和温度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度（c）成正比，即A=k2c(7-6)(4)朗伯-比耳定律当溶液厚度和浓度都可改变时，就要考虑两者同时对吸光度的影响，将朗伯定律和比耳定律合并为朗伯-比耳定律，即A=kbc(7-7)朗伯-比耳定律不仅适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，它是分光光度法进行定量分析的理论基础。应用朗伯-比耳定律的条件：一必须使用单色光，二吸收发生在均匀的介质中，三吸收过程中，吸光物质互相不发生作用。7.2.2朗伯-比耳定律在比色分析中的应用7.2.2.1吸光系数朗伯-比耳定律中的比例常数K称为吸光系数，其物理意义是：单位浓度的溶液液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度。K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度、和溶剂性质等，与溶液浓度和液层厚度无关。但K值的大小因溶液浓度所采用的单位不同而不同。（1）摩尔吸光系数当溶液的浓度以物质的量浓度（mol·L-1）表示，液层厚度以厘米（cm）表示时，相应的比例常数K称为摩尔吸光系数，以ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1。因此，式（7-7）可改写成A=εbc(7-8)摩尔吸光系数的物理意义是：浓度为1mol·L-1的溶液，于厚度为1cm的吸收池中，在一定波长下测得的吸光度。8摩尔吸光系数是吸光物质的重要参数，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力。ε愈大，该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度也就愈高。因此，测定时，选择摩尔吸光系数大的有色化合物进行测定，选择摩尔吸光系数值最大的波长作为入射光。一般认为ε﹤1×104L·mol-1·cm-1灵敏度较低；ε在1×104～6×104L·mol-1·cm-1为中等灵敏度；ε＞6×104L·mol-1·cm-1为高灵敏度。摩尔吸光系数由实验测得。在实际测量中，不可能取1mol·L-1这样高浓度的溶液来测量摩尔吸光系数，只能在稀溶液中测量后，计算出摩尔吸光系数。【例7-1】含Fe2+离子浓度500μg·L-1的溶液，与显色剂1.10-邻菲罗啉反应，生成橙红色配合物