第8酵母基因工程基因工程原理与技术刘志国课件.

第二节常见的酵母基因表达系统第八章酵母基因工程酵母菌表达载体酵母基因表达宿主系统第一节酵母基因工程表达体系第四节酵母基因工程应用举例------利用重组酵母生产乙肝疫苗酵母菌的转化系统第三节影响外源基因表达的因素酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类，共由56个属和500多个种组成。酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。第一节酵母基因表达体系---------------宿主系统作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求①安全无毒，没有致病性。②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。④培养条件简单，容易进行高密度发酵。⑤有较强的蛋白质分泌能力。⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统酵母菌是最简单的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酿酒酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵亚母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。假丝酵母属产朊假丝酵母(Candidautilis)酵母菌表达系统的选择酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。表达系统优势：生长迅速、强启动子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可诱导表达由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列多型汉逊酵母表达系统HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。系统中获得成功表达。酿酒酵母中的2m环状质粒同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP编码产物驱动IRs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STBREP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质粒类似。第一节酵母基因工程表达体系--------载体第一节酵母基因工程表达体系--------载体酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttlevector）。酵母菌-大肠杆菌穿梭表达载体是由来自酵母的部分核酸序列和细菌的部分核酸序列所组成，其原核部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的起点序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，这两个部分主要是作为在大肠杆菌宿主时增殖和筛选组分。酵母部分包括酵母转化子的筛选组分，主要是与宿主互补的营养缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。第一节酵母基因工程表达体系-------载体1．酵母载体的基本结构DNA复制起始区：2μ质粒的复制起始区及酵母基因组的自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）筛选标记：营养缺陷型筛选或者抗性筛选整合介导区有丝分裂稳定区表达盒：启动子，基因（分泌信号序列），终止子2酵母载体的种类酵母整合型质粒YIp：缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，含有酵母的筛选标记ura3基因。具有整合介导区，所以，它只有整合到酵母染色体中才能稳定(a)。酵母克隆表达载体根据其在酵母中复制形式来分类。分为下列五类：酵母载体按照用途不同可分为克隆载体和表达载体两类含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域。酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数可达60-100。转化效率高（b）。酵母复制型质粒YRp：含有来源于酵母的DNA复制起始区(ARS)，能在酵母染色体外自主复制的一种自主复制型载体，虽然其转化效率高，在宿主的拷贝数可以达上百个（c）。ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。以ARS为复制子的质粒称为YRp上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。2酵母载体的种类酵母着丝粒质粒YCp：含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，这种载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性(d)。CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CENDNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp.YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。酵母人工染色体YAC：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列（ARS）、着丝粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC载体在宿主细胞中以线性双链DNA存在，具有高度的遗传稳定性。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可接受100-1000kb的外源DNA片段。主要结构：①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌着丝粒序列(centromere4,CEN4)；③一个自主复制序列(ARS1)；④两个来自嗜热四膜虫(Tetrahymennathermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增；⑥Ampr抗性及细菌质粒复制原点；⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4tRNA基因内。酵母菌的转化系统酵母菌的转化方法用于转化子筛选的标记基因酵母菌转化方法原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。Li+盐转化方法：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍）酵母菌转化方法电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105/mgDNA）。PEG转化法：PEG1000酵母细胞转化特点单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或同源整合入染色体（不含复制子）克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%用于转化子筛选的标记基因营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因用于转化子筛选的标记基因其编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因aph氨基糖苷转移酶抗G418cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1铜离子螯合物耐受铜离子suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标记基因编码产物遗传表型第二节常见的酵母基因表达系统一、酿酒酵母表达系统1，启动子组成型表达的启动子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）启动子、甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH或GAPl）启动子可控性启动子：半乳糖启动子（GAL）、酸性磷酸酶启动子（PHO）、乙醇脱氢酶（ADH2）启动子、Cu2+螯合蛋白启动子（CUPI）以及交配a型阻遏系统（MATa/a）酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭23℃诱导表达温度控制型启动子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活酵母菌启动子的可控性a–a型启动子酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型温度控制型启动子a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子受体细胞基因组重组质粒a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子a2a125℃35℃（–）酵母菌启动子的可控性酿酒酵母超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10基因编码杂合启动子：将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子酿酒酵母表达载体目前已建立的酿酒酵母表达载体有（1）酵母附加体质粒(YEp)（见右图）；（2）酵母复制型质粒(YRp)；（3）酵母着丝粒质粒(YCp)；（4）酵母整合型质粒(YIp)；（5）酵母人工染色体(YAC)。前三类统称为游离自主复制型质粒载体。含有来自酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序列，能够自主复制，通常为多拷贝数酿酒酵母宿主有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。如pep4-3突变株中蛋白酶的活性显著降低，对外源基因表达产物的降解作