第一章抗原抗体反应.

第一章抗原抗体反应免疫学诊断技术概述(4学时)检测抗原制备技术第一节抗原抗体反应的原理第二节抗原抗体反应的特点第三节影响抗原抗体反应的因素第四节免疫学检测技术的类型第一节抗原抗体反应的原理抗原抗体反应，主要是指抗原和抗体在体外结合所表现的反应。由于抗体主要存在于血清中，并且临床上多用血清做试验，所以体外实验中的抗原抗体反应曾称作血清学反应（serologicalreaction)。但是随着免疫学的发展，血清学的含义已不能概括目前的研究内容，现在多以抗原抗体反应代替血清学反应一词。Ag:AntigenAb:Antibody第一节抗原抗体反应的原理抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。物质基础:抗原表位与抗体高变区间的互补结合抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合抗原抗体之间的结合力亲水胶体转化为疏水胶体静电引力（electrostaticforces）范德华引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氢键:最具特异性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗体结合力示意图一、抗原抗体结合力l.静电引力抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力，称为静电引力，又称库伦引力。例如，抗体分子上带电荷的碱性氨基酸的游离氨基(-NH3+)和酸性氨基酸的游离羧基(-COO-)可与抗原分子上带相反电荷的对应基团相互吸引。这种引力的大小与两个相互作用基团间的距离平方成反比。2.范德华引力抗原和抗体相互接近时，由于分子的极化作用而出现的引力，称范德华引力。结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的7次方成反比，键能约为4.2-12.5kJ/moL。这种引力的能量小于静电引力。3.氢键结合力供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体。氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比，键能约20.9kJ/mol。4.疏水作用力两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力称为疏水作用力，或称为疏水键。当抗原抗体反应时，抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，由静电作用形成的亲水层立即失去，从而促进抗原与抗体的相互吸引而结合。疏水作用力在抗原抗体反应中的结合是很重要的。提供的作用力最大，约占总结合力的50%。抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力亲和力(affinity)抗原抗体亲和力示意图二、抗原抗体的亲和力和亲合力Avidity•TheoverallstrengthofbindingbetweenanAgwithmanydeterminantsandmultivalentAbsKeq=104Avidity106Avidity1010Avidity抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度亲合力(avidity)抗原抗体亲合力示意图抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其亲和常数K=抗原抗体复合物浓度游离抗原浓度×游离抗体浓度K代表抗体结合抗原的亲和力。K值大的抗体与抗原牢固结合，不易解离，称该抗体有高亲和力。三、亲水胶体转化为疏水胶体抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血清学反应条件下均带有负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。当Ag与Ab结合后，表面电荷减少，水化层变薄；而且由于Ag-Ab复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。此时在电解质(如NaCl)的作用下，使各疏水胶体之间进一步靠拢、沉淀，形成可见的Ag-Ab复合物。可见反应抗原抗体复合物(疏水胶体)电解质抗原(亲水胶体)抗体(亲水胶体)+三、亲水胶体转化为疏水胶体第二节抗原抗体反应的特点特异性可逆性比例性阶段性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性抗原抗体反应特异性示意图分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性一、特异性两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应交叉反应（crossreactions）抗原抗体交叉反应示意图二、可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性影响因素：抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合越牢固，越不易解离环境因素对复合物的影响－pH、离子强度Ag与Ab的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显；这种现象可以用“格子学说”来解释：Ab(IgG)为二价，Ag通常为多价，只有Ag，Ab结合形成大的复合物，肉眼才可见。三、比例性格子学说Myoglobin：肌红蛋白•只有当Ag与Ab比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现，此所谓带现象；•前带现象：Ab过剩，Ag过少；稀释Ab，凝集反应常见；•后带现象：Ag过剩，Ab过少；稀释Ag、沉淀反应常见。前带现象后带现象前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalencezone)：抗原抗体比例合适抗原抗体反应比例性示意图比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系三、比例性第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象四、阶段性第三节影响抗原抗体反应的因素抗原、抗体反应物的自身因素环境因素一、反应物自身因素抗原:理化性状、表位种类和数目抗体:来源、特异性、亲和性、效价1、抗原抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集；单价抗原与抗体结合不出现可见反应；粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgG类抗体结合不出现直接凝集等。一、反应物自身因素•抗体对反应的影响表现在以下三个方面:(1)来源:来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免疫复合物；马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物；家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（8.5%NaCl）溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。2、抗体(2)特异性与亲和力:•特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。•免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低；后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。•因此，用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。（3）浓度:抗体的浓度往往是与抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。l.电解质抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出现可见反应;若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以8.5%NaCl溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中Na+和Cl-可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。二、环境因素2.酸碱度合适的pH是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以pH6-9为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。当pH为3左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假象。3.温度抗原抗体反应一般在15-40℃范围内均可进行，最适温度为37℃。在此范围内温度越高，分子运动速度加快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，但亦容易引起复合物解离;温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在4℃时与红细胞结合，20℃以上反而解离。4、作用时间抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。电解质:生理盐水或缓冲液酸碱度:pH6～pH9温度:15℃～40℃，37℃最适二、环境因素反应类型实验技术结果判断凝集反应直接凝集试验观察凝集现象间接凝集试验同上抗球蛋白试验同上沉淀反应液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉淀弧补体参与的反应补体溶血试验观察测定溶血现象补体结合试验同上第四节免疫学检测技术的类型反应类型实验技术结果判断中和反应病毒中和试验检测病毒感染性毒素中和试验检测外毒素毒性标记免疫反应荧光免疫技术检测荧光现象放射免疫技术检测放射性强度酶免疫技术检测酶底物显色发光免疫技术检测发光强度金免疫技术检测金颗粒沉淀原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如果二者相应，则可在抗原、抗体两液接触界面形成白色的沉淀环环状沉淀反应试验组阳性对照组阴性对照组原理：可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种AgAb系统的沉淀物。双向琼脂扩散试验检测抗原制备技术•抗原是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性反应的物质，或称免疫原。•完全抗原:反应原性+免疫原性•半抗原(不完全抗原):只具备反应原性而无免疫原性的物质。•来源于病原体及其病原体的代谢、分泌和排泄物等天然抗原，均可作为良好的检测抗原。•其种类，因病原体的种株不同而异。微生物中的衣原体、支原体、细菌、螺旋体、立克次体、真菌和放线菌等病原体表层结构蛋白以及各种外毒素、内毒素和酶等毒力因子，噬菌体、病毒的各种结构蛋白，如衣壳蛋白、包膜上的各种糖蛋白、基质蛋白以及病毒编码的复制酶等均是良好的检测抗原。•大多数寄生虫是多细胞生物，其抗原具有复杂性、多源性，同时又具有种属和生活史不同期的特异性。来源于虫体结构性物质的虫体抗原、虫体排泄物和分泌物中的蛋白或多肽类、糖脂或多糖等代谢性抗原以及生活虫体排放或脱落到宿主体内可出现于血循环的大分子微粒性循环抗原等均可作为检测抗原。•抗生素等药物因其分子量较小，不具有抗原性。与牛血清白蛋白等大分子偶联后才具有完全抗原的特性。•来源于自然感染或人工感染以及人工培养病原生物体的生物大分子物质，如蛋白质、多肽、酶类等，必须进行分离纯化，才能作为特异性较好的检测抗原。•分离纯化方法有选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、电泳法、超速离心法、层析法等。•其中用于蛋白质和酶的提取，多采用选择性沉淀法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法。（一）分离纯化法（1）饱和硫酸铵法：盐析沉淀法是经典的蛋白质和酶纯化分离技术。最常用的方法是以33%~50%的饱和硫酸铵依次沉淀3次。将盐析沉淀后的蛋白质溶液装入透析袋中，用蒸馏水或缓冲液，4℃冰箱内进行透析，更换蒸馏水或缓冲液3次，直至袋内盐充分透析除尽为止。此外，亦可用葡聚糖凝胶层析法脱盐。（一）分离纯化法（2）有机溶剂沉淀法：常用乙醇或丙酮，加入时应搅拌均匀，pH值大多控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，置4℃冰箱内进行。（3）分子筛层析法：又称凝胶过滤法，它是利用分子筛将抗原分成大、中、小三种类型。特别是经过初步纯化后的蛋白质和酶抗原采用此种方法进一步纯化，效果尤为显著。（一）分离纯化法（4）亲和层析法：亲和层析法则是利用生物大分子的生物学特异性而设计的层析分离技术。例如抗原抗体、酶和酶抑制剂或配体、酶蛋白和辅酶、DNA和RNA、激素和受体等之间具有特殊的亲和力，在一定条件下，二者能紧密结合形