第一章文献综述抗坏血酸

生物体中的抗坏血酸前言：抗坏血酸(AscorbicAcid，ASA)即维生素C(VC)，是植物体内合成的一类含量丰富的己糖内酷化合物，其化学名称是L一苏糖型一六·2一烯醇一1，4一内酷，由烯二醇基团和五元杂环内醋构成的二梭酸(Robert和Roberto，2005)。植物中ASA的重要性不仅在于它为不能正常合成ASA的少数动物(包括人类)提供丰富的维生素C源，还在植物自身的抗氧化作用、光合保护以及调节生长发育中发挥非常重要的生理功能。最近几年对ASA在植物中的代谢及功能有了深入的研究，特别是ASA生物合成新途径的提出，为将来的研究奠定了重要基础。本章主要就抗坏血酸在植物体内及人体的含量，形态和功能，代谢途径、应用等几个方面的研究进展作一综述。关键字：抗坏血酸vc一．植物体中的抗坏血酸1.1ASA的结构与功能ASA的稳定性源自于∏电子在羧基和烯二醇基团系统上的离域，它的酸性由C3决定。ASA的氧化产物是脱氢ASA，脱氢ASA是由C6上的羟基和C3闭合而成的双环离子基，未成对的电子落在C4区域，使得离子基显电中性。作为植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质，ASA具有很多特殊的功能。一般而言，在植物中，抗酸血酸通过作为一些酶的辅酶、自由基清除剂、叶绿体和质膜电子供体或受体以及作为植物草酸盐和酒石酸盐生物合成的底物等四个方面的作用而发挥其生物学活性。1.2.作为一些酶的辅酶在植物和动物中，ASA的一个重要功能是调节一系列重要的酶促反应。包括赖氨酸羟基化酶、脯氨酸-2-酮戊二酸-3-二氧化物酶和氨基环丙烷羧基氧化酶在内的这些活性位点含有铁和铜的单氧或二氧化物酶需要ASA作为辅酶，ASA可以使这些酶反应中心的金属离子保持在还原状态而提高酶的活性[46]。ASA可直接参与植物羟脯氨酸富集的蛋白质，如伸展素的合成而影响细胞的伸长与分裂[47,48]。因为伸展素可以调节含羟脯氨酸的糖蛋白，ASA因此而参与了植物细胞壁的交联作用以响应机械创伤和病源菌攻击。ASA还能够活化黑芥子酶（葡萄糖硫苷葡糖水解酶），该酶可催化芥子油苷水解为D-葡萄糖和一个糖苷配基片段。此外，ASA可以作为氨基环丙烷羧基氧化酶（ACC氧化酶）和赤霉素3-二氧化物酶的辅酶而参与植物激素乙烯和赤霉素的生物合成；作为紫黄质环氧化酶辅酶而参与黄素循环中光保护色素的生物合成。1.3植物ASA库与环境胁迫作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，ASA的一个重要功能是保护叶绿体免于氧化损伤。光合作用和光呼吸过程可以产生活性氧自由基（ROS）。细胞基质和类囊体结合的SOD和APX在清除叶绿体产生的O2和H2O2过程中起着重要作用。在叶绿体中，APX利用ASA可将H2O2还原为水，同时可形成MDHA。MDHA的半衰期很短，可很快不成比例地被还原为ASA或氧化为DHA。在植物细胞中，MDHA既可以作为内囊体膜外侧上的还原型铁氧还蛋白的直接电子受体而直接被还原为ASA，也可以通过ASA-谷胱甘肽循环（ASA-GSH循环）酶促还原为ASA。ASA-GSH循环由一系列酶促反应组成，最初由Foyer和Hal-liwell提出，该循环通过依赖NADPH的氧化而与H2O2的脱毒密切相关。在这一循环途径中，由APX催化的H2O2还原时产生的MDHA，可在NAD（P）H依赖的单脱氢抗坏血酸还原酶（mono-dehydroascorbatereductase，MDHAR）的作用下还原为ASA。尽管MDHA可能以酶促或非酶促的形式再生为ASA，但MDHA的不成比例还原说明，在ASA被氧化过程中有一部分MDHA被进一步氧化为DHA。以GSH为还原性底物，DHA可在脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbatereductase，DHAR）的作用下被还原为ASA。该反应产生的GSSG在NADPH的存在下又可被再还原为GSH，催化酶为谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase，GR）。ASA-GSH循环依赖于来源于叶绿体光依赖的电子传递反应而产生的还原力或由葡萄糖-6-P脱氢酶和苹果酸脱氢酶的作用而产生的NADPH。ASA-GSH循环中的酶类高活性地存在于叶绿体，但在其它细胞区间如胞质、过氧化物体和线粒体中也具有相当的活性以驱动H2O2的清除过程。在活细胞内，ASA氧化还原系统由还原型（ASA）、半还原型（MDHA）和氧化型（DHA）分子组成。在胞内环境，众多酶循环途径可使ASA库保持在相当的还原水平；而在胞外环境，ASA的氧化还原状态更多地依赖于物种差异和植株所处的生理状态。ASA库在植物细胞的胞内和胞外环境中所处的相对氧化还原状态以及维持该状态所涉及代谢物质或酶的水平或活性的改变，对植物抵抗一系列环境胁迫非常重要相当多的研究资料表明，ASA的含量、氧化还原状态（ASA/DHA比率）及其合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列人为环境胁迫的响应。盐胁迫可引起小麦植株ASA含量的明显降低，盐耐受品种的降低幅度小于盐敏感品种，而代谢相关酶APX的活性受盐胁迫刺激[55]。在西红柿根中，Shalata等[56]发现，盐胁迫使盐敏感品种的ASA含量降低，DHA的含量明显升高，ASA/DHA比率降低，代谢相关酶APX和MDHAR活性也降低；然而盐耐受品种与之刚好相反，表明西红柿较高的抗盐性，至少部分地来自于ASA含量、ASA/DHA比率和某些相关酶活性的提高。干旱胁迫也可导致ASA含量及其代谢的改变。Li和VanStaden发现，水分胁迫可导致玉米ASA水平的降低，APX活性也低于对照。Schwanz等报导，干旱使橡树总ASA含量降低而还原型ASA含量升高。我们在小麦上的研究发现，田间缓慢干旱可导致春小麦叶片总ASA库和还原型ASA含量的大幅升高，同时抗氧化关键酶APX的活性也相应升高，表明ASA合成和代谢速率的上调参与了作物对缓慢干旱逆境的响应[59]。以生长于甘肃河西地区沙漠境内的不同生态型芦苇为材料的研究发现，两种陆生生态型芦苇（沙丘芦苇和重度盐化草甸芦苇）具有比水生芦苇为高的ASA/DHA比率，ASA相关代谢酶如APX、DHAR和MDAHR的活性也于沙芦和盐芦中高于水芦，表明ASA代谢速率和氧化还原循环能力的上调涉及芦苇植物对其长期不利生境如干旱和盐渍的适应[59]。ASA库及其氧化还原状态涉及植物对环境胁迫的响应的现象也被其它一些研究所证实。质外体ASA的水平和氧化还原状态对植物响应环境胁迫也具有十分重要的作用。质外体ASA可能涉及保护植物质膜免受环境胁迫导致的氧化损伤，尤其当植物遭受臭氧或其它大气污染物胁迫时。Burkey等发现，在臭氧胁迫条件下，食荚菜豆叶中总ASA的含量耐受品种比敏感品种高，且耐受品种能维持相对较高的ASA库水平;此外，质外体总ASA含量耐受品种远远高于敏感品种，其ASA（ASA+DHA）比率也相对较高，表明植物臭氧忍耐性与质外体ASA的含量和氧化还原状态密切相关。由于质外体并不含有ASA-GSH循环中的绝大多数酶，所以质外体ASA水平及其氧化还原状态的维持进一步表明植物中存在特殊的ASA转运机制。由于ASA直接参与细胞壁的伸长和木质化过程，因而植物质外体ASA在环境胁迫条件下维持高水平和高还原性具有特殊重要的生理作用1.4ASA在植物生长发育中的作用高等植物的生长是细胞增殖和伸长的结果。已经发现，ASA和AAO（ascorbateoxidese，AAO）直接或间接地参与植物细胞的增殖和伸长过程，因而在植物的生长发育过程中具有重要的生理作用。研究发现，ASA及其氧化产物可以通过多种途径影响植物细胞的伸。作为Fe-二氧化物酶的辅酶，ASA参与了细胞壁蛋白的翻译后修饰，DHA可以和这些蛋白的赖氨酸和精氨酸侧链发生反应以阻止蛋白质的交联。ASA还能够直接清除参与木质素合成的单木质素自由基，可逆性地抑制对单木质素自由基形成负责的细胞壁或质外体过氧化物酶的活性，抑制这些自由基的翻转和向质外体或细胞壁的分泌[66,67]。研究发现，细胞壁中存在的APX能够通过减少H2O2的生成而维持细胞壁的塑性，添加外源MDHA（而不是ASA）可以促进葱的生长和生根，而且这种促进效应是与细胞延展性的增加和质膜H+-ATPase活性的被刺激相关联的。此外，ASA还可以作为草酸生物合成的底物。已经发现，质外体草酸能够捕获钙离子，因而影响了果胶质的交联和细胞壁的伸长，而质外体草酸的浓度又受一种具有草酸氧化酶活性的胞壁富集蛋白的反向调节，该酶阻断草酸与CO2和H2O的结合，可促使钙离子和H2O2的释放，从而刺激了细胞壁的硬化[46,63]。可见，尽管很难评价这些机制在细胞壁伸展方面的相对贡献大小，但可以确定，ASA能够调节细胞壁代谢的很多基本方面。从这点上说质外体ASA的氧化还原状态以及ASA和H2O2水平之间的平衡将直接或间接地影响细胞壁的木质化程度和胞壁物质的交联作用。质外体ASA水平和氧化还原状态可能受胞壁AAO的调节，该酶的表达已经被证明与细胞周期的特殊阶段和细胞生长密切相关。除影响细胞伸长，ASA还影响植物细胞的分裂和分化。已经发现，外源ASA可以提高正在经历G1S细胞周期转变的细胞的数量，从而加速了Pisum和Lupinus根尖原始细胞的增殖作用[69,70]。对玉米根静止期（由大量处于G1期的未分裂细胞组成）的研究显示，该期细胞含有很高水平的AAOmRNA、蛋白质和酶活性，且这种AAOmRNA、蛋白质和酶活性的高水平是与极低的ASA水平相关联的。在玉米和葱中，添加外源ASA可以刺激处于静止期的细胞重新进入细胞周期。因为AAO活性的直接产物是MDHA，所以这些结果是与人们观察到的MHDA刺激葱属植物根生长的现象相一致的。最近，Kato和Esaka在烟草BY-2悬浮细胞培养过程中发现ASA含量在细胞分裂时升高，并认为G1期DHA浓度的提高可以缩短细胞周期并促进细胞伸长。因为AAO的水平与DHA浓度的增加成正相关，这一结果表明AAO和ASA/DHA比率对控制细胞分裂周期具有重要作用。然而在拟南芥根中，人们发现，ASA、GSH和非专一性还原性试剂如二硫苏糖醇均可刺激根原分生组织中细胞的分裂，进而促进了其它分生组织的分裂。因为外源GSH和ASA均可逆转因GSH生物合成抑制而引起的细胞分裂的停止，因而ASA-DHA和GSH-GSSG氧化还原对的氧化还原状态可能在植物细胞周期的调控中具有重要作用[45,46]。AAO是一种属于铜氧化酶家族的酶，该酶催化ASA氧化为MDHA，同时伴随着分子态氧被还原为水。已经发现，AAO是一种细胞壁酶，其编码基因已经从多种植物中被分离。该酶受生长素诱导并在快速生长的植物组织和正在萌发的植物种子中高水平表达，其mRNA和蛋白也在植物花、子房和幼果中高水平表达。尽管人们对AAO的生理功能依然不是十分清楚，但是如上所述，AAO参与了植物细胞的伸长和/或分裂过程的调控。AAO的这种生理功能，可能是通过调节细胞内的重要氧化还原对ASA-DHA的氧化还原状态来实现的。1.5植物ASA的生物合成与代谢很早就发现ASA广泛存在于植物体内，几乎所有植物细胞器中都存在。例如，叶绿体可积累浓度很高的ASA，达到叶片总ASA含量的12～30%。ASA也稳定存在于质外体、胞质和液泡中[76-78]。线粒体中也存在大量ASA，因为催化其生物合成最后一步的L-半乳糖酸-C-内酯脱氢酶（GLDH）存在于线粒体。研究发现，胞外ASA库在正常生理条件下多处于还原状态，而在氧化胁迫条件下，ASA库的氧化程度增加。但ASA生物合成途径直到最近才从Pisumsativum和拟南芥的研究中搞清楚。ASA生物合成直接前体L-半乳糖酸-C-内酯（GL）的合成过程，涉及D-葡萄糖-6-P、D-果糖-6-P、D-甘露糖-6-P、D-甘露糖-1-P、GDP-D-甘露糖、GDP-L-半乳糖、L-半乳糖-1-P和L-半乳糖等中间产物。植物ASA生物合成的L-半乳糖途径简示如下：D-葡萄糖→→D-甘露糖-1-P→GDP-D-甘露糖←→GDP-L-半乳糖→（L-半乳糖-1-P）→L-半乳糖→L-半乳糖酸-1-P，4-内酯→L-A