第七章发酵工程制药_生物技术制药.

第二章发酵工程制药第一节概述一、发酵工程微生物工程:自催化过程完整的工业体系(一)发酵的定义1、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。3、工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。(二)发酵工业定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。发酵食品有机酸氨基酸核酸类物质酶制剂医药工业（抗生素…）饲料工业（单细胞蛋白环境工程（废物处理）其它（冶金工业…）抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等(1)传统生物技术(2)现代生物技术基因工程菌发酵二、发酵类型1、微生物菌体发酵定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。2、微生物的酶目前的酶多数来源于微生物发酵医用酶制剂的生产医药工业用酶酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。3、微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。1,3-丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等4、微生物的生物转化定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。三、微生物发酵生产药物的分类（一）抗生素类9000种微生物发酵占70％。有价值的抗生素，几乎全部由微生物生产抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等（二）氨基酸类单个氨基酸制剂：复方氨基酸制剂：微生物发酵法：酶转化法黄色短杆菌合成赖氨酸的途径（三）核苷酸类肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，辅酶等（四）维生素类维生素C的原料药2-酮基-古龙酸，维生素A的前体B-类胡萝卜素，维生素D2的前体麦角甾醇，维生素B2，B12等（四）甾体类激素甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借助微生物的反应。（五）治疗酶及酶抑制剂药用酶酶抑制剂四、发酵工程制药特点及发展趋势（1）菌种是根本（2）理论产量存在“生物学变量”（3）常温常压下反应，安全，条件简单（4）纯种培养，防污染（5）可制备复杂高分子化合物（6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等（7）发酵工业成本低菌种选育自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程培养基配制根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方灭菌杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等分离纯化菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换发酵工程基本流程发酵的基本过程发酵的基本过程:菌种种子制备发酵预处理提取精制典型发酵过程第二节、发酵工程中的微生物一、常见的药用微生物发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌细菌放线菌（一）细菌主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等（二）放线菌产抗生素最多的一类微生物另外生产B12,酶，甾体转化抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：放线菌（链霉素；四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源链霉菌（三）真菌抗生素维生素酶制剂有机酸等药用真菌（大型真菌）1.藻状菌纲：根霉；犁头霉2.子囊菌纲：酵母3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶二、生产菌种的选育工业化菌种的要求1.遗传性能要相对稳定2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体3.目标产物产量接近理论转化值4.目标产物分泌到胞外5.尽可能减少类似物产量6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。（1）自然选育1采样2.分离菌株自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。平板分离(注意形态的观察)发酵试验单细胞(孢子)悬液的制备挑选单菌落礼来公司花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。（2)自发突变与定向育种一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发突变体结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。筛选抗性株，可成为高产株抗性突变株的筛选直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产菌种选育突变、体内重组体外重组（基因工程）（3）诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,5-Br-U{物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线，快中子；目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。化学诱变剂：碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。使用最多、最有效的是烷化剂。大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效诱变育种步骤•出发菌株的选择•处理菌悬液的制备•诱变处理•中间培养•分离和筛选筛选的方法随机筛选形态理性化筛选（4）杂交育种通过有性生殖进行(5)原生质体融合两个细胞融合1.原生质体融合的一般程序去细胞壁融合筛选2.酶溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等（6）基因重组进化育种错位PCR基本步骤(1)用DNaseI消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装记过程中被证明有低水平点突变产生。3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。1.自身耐药突变株2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株3.营养缺陷及其回复突变株筛选饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质三、菌种保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。斜面低温法：短期保存石蜡油封存法：中期保存沙土管：产孢子和芽孢的麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用甘油悬液法：基因工程菌冻干保藏：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输液氮法：最为有效，保藏15年以上，宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物第三节、发酵设备及消毒灭菌一、发酵设备发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一一个优良的培养装置应具有：严密的结构良好的液体混合性能高的传质和传热速率灵敏的检测和控制仪表1、搅拌釜式反应器：目前使用最广泛的发酵反应器机械搅拌发酵罐1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高2）能耐受一定的压力3）搅拌通风装置4）足够的冷却面积5）罐内要减少死角6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露罐体：培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为2.5×105Pa形状，圆柱形，两端椭圆形,受力均匀，减少死角，物料容易排除，高度与直径比1.7-4：1，有力空气利用率搅拌器档板克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧速率消泡器锯齿式、梳状式及孔板式装于搅拌轴上，齿面略高于液面直径罐径的0.8~0.9罐体表面各种装置：中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口（二）发酵辅助设备无菌空气系统：过滤除菌（使用活性炭，石棉滤板，多孔合成树脂等）灭菌系统发酵车间的管道阀门等发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3高空取气管是远离地面几十米的管子。地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级因此从高空取气要比从低空取气有利得多。油水分离器其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。发酵车间的空气过滤器二、培养基和灭菌（一）培养基C源：N源：无机盐：前体，促进剂，抑制剂2.培养基的类型孢子培养基：一般用固体培养基，N源不能丰富如：小米或麸皮培养基种子培养基：速效的C,N源，与发酵培养基过渡发酵培养基：迟效与速效的C,N源搭配，加前体等（二）灭菌方法1.空罐灭菌：高压水蒸气，消灭死角当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌蒸汽下进上出2.实罐灭菌：效果最好，121度，30-50分钟三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。3.连续灭菌：营养破坏最少，128-138度，8-12分钟。发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品二、种子的制备种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。谷氨酸生产的种子制备斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵1、斜面培养基：蛋白胨1%，牛肉