第三章+生物信息的传递(下)翻译.

生物信息的传递（下）—从mRNA到蛋白质DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制翻译：指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是蛋白质合成的模板是模板与氨基酸之间的接合体是蛋白质合成的原料是核糖体mRNAtRNA20种氨基酸●遗传密码——三联子●tRNA的结构、功能与种类●核糖体的结构与功能●蛋白质合成的过程●蛋白质的运转机制第一节遗传密码——三联子1,基本概念2,遗传密码的研究历史3,遗传密码的性质一、遗传密码——三联子（一）三联子密码定义mRNA链上每三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为密码子或三联子密码(tripletcoden)。mRNA5’GCUAGUACAAAACCU3’一、遗传密码是三联体的推测1、遗传密码的前期测想1944年奥地利物理学家薛定谔(E.Schrodinger)出版了(Whatislife)一书,书中指出:生物学和物理学的主要问题是有机体的信息传递问题,基因由许多异构单位组成,这些单位的确切性和连续性决定着微型密码.微型密码是丝毫不错的对应于一个高度复杂的特定发育计划,并且包含了使密码发生作用的手段,这一点已经不是难以想象的了.（二）三联子密码破译2、遗传密码是三联体的推测1954年俄裔美国理论物理学家伽莫夫（G.Gamow）在自然杂志发表《脱氧核糖核酸与蛋白质之间的关系》论文，提出遗传密码的构想，认为在双螺旋结构中，四个碱基之间形成一定空穴游离氨基酸进入空穴形成多肽链，四个碱基中由三个碱基决定一种氨基酸，因为氨基酸有20种.一个碱基决定一种氨基酸时只能决定41=4种两个碱基决定一个氨基酸时只能决定42=16种三个碱基决定一个氨基酸时能决定43=64种重叠的密码子更为经济有效???mRNA5′AUCGACCUGAGC3′420(×)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′42=1620(×)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′43=6420(√)核苷酸序列氨基酸序列二、遗传密码是三联体的证实1961年，克里克与布伦纳合作，利用大肠杆菌的T4噬菌体作实验。T4噬菌体r+：能在大肠杆菌B菌株生长形成嗜菌斑能在大肠杆菌K菌株上生长形成嗜菌斑T4噬菌体r¯:不能在K菌株上生长，不形成嗜菌斑用可以引起移码突变的丫啶类药物处理野生型噬菌体，在此噬菌体DNA发生缺失1个、2个、3个或插入1个、2个、3个核苷酸的各种突变类型1、缺失一个核苷酸时在K菌株上不生长ABCABCABCABCABCABCABCABCABABCABCABCABCABC插入一个核苷酸时在K菌株上不生长ABCABCABCABCABCABCABCABCABCCABCABCABCABCABC2、缺失两个核苷酸时在K菌株上不生长ABCABCABCABCABCABCABCABBCABCABCABC插入两个核苷酸时在K菌株上不生长ABCABCABCABCABCABCABCABCABCCABCABCCABCABCABC3、缺失三个核苷酸时在K菌株上生长（拟野生型）ABCABCABCABCABCABCABCABABABABCABC插入三个核苷酸时在K菌株上生长（拟野生型）ABCABCABCABCABCABCABCABCABCCABCABCCABCCABCABC以上实验证明遗传密码是三联体，因为，若是二联体时，缺失或插入三个核苷酸时不会成为拟野生型的，既不能在K菌株上生长以上试验结果还表明,三联体密码是非重叠,而且连续编码并无标点符号隔开,这是基因与蛋白质共线性的最早证据.三、遗传密码的破译Nirenberg尼伦伯格,1927-敏锐,大胆,睿智和创新是科学家的重要素养,一个善于捕捉细节的人才是能领略事物真谛的人.一1968年诺贝尔生理学或医学奖获奖时说1、初步破译1961年春天，当克里克和布伦纳在讨论论证遗传密码为三联体的时候，美国两位年轻的生化学家尼伦伯格（M.W.Nireberg）和马太（J.H.Matthaei）就开始悄悄的进行遗传密码的破译。大肠杆菌无细胞蛋白合成体系背景资料1961年Nirenberg建立了无细胞系统这一新技术又是在多核苷酸磷酸化酶发现的基础上建立起来的。1955S.Ochoa在细菌中分离了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）,合成RNA时不需要DNA模板，使结合上去的核苷酸完全是随机的。(奥乔亚Ochoa,1959)SeveroOchoaMonumentoutsidetheSchoolofMedicineoftheComplutenseUniversityofMadrid，Spain.(September24,1905–November1,1993)wasaSpanish-Americanbiochemist,In1959,OchoawasawardedtheNobelPrizeforPhysiologyorMedicineforhisworkonthesynthesisofRNA.方法是:(1)大肠杆菌细胞破碎，离心除去细胞碎片(2)去模板：370C温育，内源mRNA模板降解（3）加入polU：合成了多聚苯丙氨酸。（4）试管中的氨基酸只用14C标记，根据标记结果推断合成的氨基酸种类。1、初步破译UUUUU20atRNAaseUUUUU20atRNAaseUUUUU20atRNAase标赖标苯丙标苏××每一个试管中的20种氨基酸只用14C标记一种氨基酸，共用20个试管，结果发现用人工合成的多聚U时得到的是多聚苯丙氨酸，说明苯丙氨酸的遗传密码是UUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA20atRNA20atRNA20atRNAaseasease标赖标苏标色说明赖氨酸密码子是AAA××用同样方法证明CCC为脯氨酸的密码子GGG为甘氨酸的密码子1961年8月尼伦伯格在莫斯科召开的第五届国际生化会议上宣读了论文，与会的代表们异常兴奋，讨论热烈，尤其是参加会议的克里克、沃森听完后激动万分，意识到彻底破译遗传密码的时刻已经到来，分子生物学将面临一次大的飞跃。遗传密码已证明为三联体，四个密码已有代表的氨基酸，有64种密码子，那么：另外60种决定什么氨基酸呢？另外16种氨基酸的密码子是什么呢？•在取得第一阶段突破性成果之后，尼伦贝格用混合的核苷酸制备人工合成的mRNA模板，分别测试其作用。由于当时还未分离RNApol酶，无法按设计的模板来合成RNA，Nirenberg又想出了一种新的方法，就是按一定的碱基比例来合成RNA。2、进一步破译按比例加入２种核苷混合的多聚物比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，碱基比为U：G＝5：1，它们能组成8种三联体：UUU，UUG，UGU，GUU，GGG，GGU，GUG，UGG。U和G将随机地加入到三联体中，这样按比例各个位于上进入U和G的概率不同，如氨基酸测定结果：•如UUU：UGG＝（555）:（511）＝25：1•同理UUU：UUG＝5：1，•根据检测结果推测:•苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）＝5：1•苯丙氨酸（UUU）：缬氨酸（GUU）＝5：1•苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GUU）＝5：11961—1964年，美国国立卫生研究院的尼伦伯格、利用建立的无细胞反应系统：U=0.87A=0.13U=0.39U=0.76C=0.61G=0.24含UA的RNA含UC的RNA含UG的RNARNA中每种核苷酸的比例取决于各种核苷酸的比例多核苷酸链UAUCUG密码子推断相对碱基含量U=0.87U=0.39U=0.76A=0.13C=0.61G=0.24以U3为100%时三联体相对几率U3=100U3=100U3=100U2A=13U2C=157U2G=32UA2=2.2UC2=244UG2=10.6A3=0.3C3=382G3=3.4苯丙氨酸100100100U3精氨酸001.1丙氨酸1.900丝氨酸0.41603.2U2C脯氨酸02850UC2酪氨酸1300U2A异亮氨酸121.01.0U2A缬氨酸0.6037U2G亮氨酸4.917936U2CU2G半胱氨酸4.9035U2G色氨酸1.1014UG2甘氨酸4.7012UG2在UA中、UC中、UG中U3作为100时苯丙氨酸出现的频率为100，则苯丙氨酸的密码子为U3在UC中U2C概率为157，丝氨酸出现的频率为160，则丝氨酸的密码子为U2C（UUC、UCU、CUU）在UC中UC2概率为244，脯氨酸的频率为285，脯氨酸的密码子为UC2（UCC、CUC、CCU）在UA中U2A概率为13，酪氨酸的频率为13，酪氨酸的密码子为U2A（UUA、AUU、UAU）用此方法搞清了许多氨基酸的密码子组合，但仅仅是知道组合，具体的顺序搞不清，例如：U2A组合，是UUA还是AUU还是UAU呢？U2C组合，是UUC还是UCU？还是CUU呢？上表中可以看到U2G可代表缬氨酸又可代表半胱氨酸和亮氨酸，究竟代表那一种呢？•为了搞清密码子中核苷酸顺序，尼伦贝格巧妙地设计了第三阶段的实验。他采用的是核糖体结合法新技术，并且加入的模板一律改为具有一定顺序的单个三联体。实验仍在无细胞体系中进行。他们的小组合成了全部64种单个的、顺序固定的三联体密码。实验结果能使50种密码子所对应的氨基酸能确定下来。实验中发现，有三个密码子并不编码任何氨基酸，后来知道它们是终止信号。3、完全破译1964年，尼伦伯格发现蛋白质翻译过程中三个特点:每一种氨基酸在酶作用下与自己对应的tRNA结合tRNA能识别自己所携带的氨基酸的三联体密码三联体密码都在核糖体上，翻译起始后形成一个复合体tRNA核糖体mRNA三氨基酸联体密码上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。第一步：人工合成只含三个核苷酸的片段，如UUG、UGU、GUU等第二步：将三个核苷酸的片段与大肠杆菌核糖体结合第三步：配制含20种氨基酸和相应tRNA的溶液1—20号，每号溶液中各有一种氨基酸是14C标记的第四步：将含有核苷酸片段的核糖体、配制的溶液加在一起，然后硝酸纤维素膜过滤，其他东西可以滤掉，但核糖体过滤不掉，测定核糖体上的放射性可以知道那种氨基酸结合到了核糖体上，测知那种氨基酸的密码子123420核糖体核糖体核糖体核糖体核糖体5UUG35UUG35UUG35UUG35UUG3tRNAtRNAtRNAtRNAtRNAaaaaa色氨酸赖氨酸亮氨酸组氨酸丙氨酸过滤膜上过滤膜上过滤膜上过滤膜上过滤膜上无放射性无放射性有放射性无放射性无放射性…...用此方法测得UUG是亮氨酸的密码子起始密码的确定：Nirenberg的三联体结合试验是在体外进行的试验，合成时能从任何一个密码子开始，可以合成任意一个氨基酸开头的多肽链。分不清哪个是起始密码子1966年，剑桥分子研究中心A.J.Clark等发现在体内进行合成的多肽链，其开头在细菌都为甲酰甲硫氨酸，在真核生物都为甲硫氨酸，且都是从AUG这个密码子开始，因此，把AUG定为起始密码子。123420核糖体核糖体核糖体核糖体核糖体5UAA35UAA35UAA35UAA35UAA3tRNAtRNAtRNAtRNAtRNAaaaaa色氨酸赖氨酸苏氨酸精氨酸酪氨酸过滤膜上过滤膜上过滤膜上过滤膜上过滤膜上无放射性无放射性无放射性无放射性无放射性说明UAA为终止密码子，同样方法测得UAG、UGA也为终止密码子终止密码子的破译：1965年剑桥分子研究中心的Brenner,发现E.coli一些无义突变型是在色氨酸位置上变化,由UGG变成UGA，把UGA定为终止码在酪氨酸位置上变化，由UAC、UAU变成UAA、UAG，所以把UAA、UAG码子也定为终止密码终止密码子的推测：Nirenberg的试验发现UAA、UAG、UGA三个密码子不能代表任何的氨基酸。重复共聚物法破译遗传密码：1965年美国Khorana设计了更为巧妙的方法合成2个、3个或4个核苷酸为单位的重复mRNA片段通过对比各片