第三章_培养基设计-3.

大纲要求：掌握培养基的主要营养成分及其作用。了解培养基的主要类型及其特征。掌握培养基配方设计的一般思路。第三章工业发酵培养基设计能力培养能正确选择工业发酵培养基的材料；能配制适合不同发酵阶段需要的培养基。第三章工业发酵培养基第一节培养基的要求及成分来源第二节培养基类型第三节培养基的设计原理和优化方法***培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基的作用：满足菌体的生长促进产物的形成第一节培养基的要求及成分来源一、设计工业发酵的培养基应遵循原则***1、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；2、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转换率。3、有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。4、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。5、尽量减少副产物的形成，便于产物分离纯化。6、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7、所用的原料尽可能减少对发酵过程中的通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率。降低能耗。8、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质。二、培养基的营养成分1、碳源构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，提供生物生命活动中所需能源的原料。糖类、油脂、有机酸、低碳醇和碳氢化合物。速效碳(葡萄糖)：迅速利用的碳源，有利于菌体的生长。但对许多产物合成有阻遏作用。缓效碳（糊精）：多数有利于产物的形成。***边糖化边发酵工艺原理及应用。工业上常用的糖类①葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖但是过量使用往往会引起“葡萄糖效应”葡萄糖过多，会引起葡萄糖效应***即会过分地加速菌体的呼吸，使培养基中的溶解氧供不应求，使一些中间代谢产物（如丙酮酸、乳酸、乙酸等）不能完全氧化而积累在菌体内或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。②糖蜜糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大•淀粉制糖过程考察指标•葡萄糖值——DE值(dextroseequivalentvalue)•DX值糖化液中葡萄糖含量占干物质的百分率为DX值。%100(%)(%)DE干物质含量还原糖含量值%100(%)(%)DX干物质含量葡萄糖含量值糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）可用亚铁氰化钾，除铁。②淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的α-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低难利用，可以解除葡萄糖效应。例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶的影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2③、醇类：甘露醇、甘油、低浓度的乙醇。④、脂肪酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸。油酸和亚油酸⑤、正烷烃：14C至18C的直链烷烃混合物。嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响结果：各种碳源相差不大推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型苏勤，林业化学与工业，2004二、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水尿素，硫酸铵（铵盐）、气态氮特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4→2NH3+2H2SO4NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH生理酸性物质，如硫酸胺生理碱性物质，如硝酸钠***正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。***所以选择合适的无机氮源有两层意义：(1)满足菌体生长;(2)稳定和调节发酵过程中的pH。在制液体曲时，用NaNO3作氮源，菌丝体长得粗壮，培养时间短，且糖化能力较高。因为NaNO3的代谢得到的NaOH可中和曲霉生长中释放的酸，使pH稳定在工艺要求的范围之内。举例：以链霉素为例，合成1mol链霉素需要消耗7mol的NH3。生产中采用流加氨水。***使用氨水时要注意：(1)要少量多次流加，加强搅拌，防止局部过碱。（2）使用前用石棉等介质过滤，除去多种嗜碱性微生物，防止染菌。氨水2、有机氮源来源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。***玉米浆是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50％。可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。玉米浆使用什么样的玉米浆才能使发酵的进程更优化、发酵结果更稳定？***因为液体玉米浆不均一、稳定性差、极容易沉淀，夏天更易染菌变质而导致其有效成分的丧失或不足，从而影响发酵的稳定性。所以，现今微生物技术领先的大型发酵企业（尤其是某些技术先进的抗菌素和酶制剂厂家）都纷纷改用玉米浆的最新换代产品——“高氮”型玉米浆干粉，因其有着极大的优点，且蛋白质含量可高达50%.氮源使用时要注意的问题1.有机氮源和无机氮源应当混合使用***早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源。中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质。•实验室中常用：玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。•工业生产上常用：硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等。2、合适的C、N比C：N＝f(菌种、发酵阶段、碳源种类、氮源种类、通气强度、搅拌强度等等)，无完全统一的标准。***•***一般来说，细菌和酵母细胞的碳氮比为5:1，霉菌细胞的碳氮比为10:1，所以霉菌培养基的碳氮比大而细菌的碳氮比小。•考虑产物，以谷氨酸为例，一般工业的发酵培养基碳氮比是100：0.2～2.0，而谷氨酸发酵培养基的碳氮比是100：15～21，当C:N＝100:0.5时只合成菌体，不产谷氨酸，当C:N＝100:11以上才开始合成谷氨酸。对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。快速利用和缓慢利用的碳、氮源的结合。氮源：过多――生长过于旺盛、pH偏高、代谢产物积累不利。过少――菌体量少，影响产量。碳源：过多――pH容易下降。过少――容易引起菌体衰老和自溶。工业C:N的范围：100：0.2～2.0吉林坨牌玉米粉:尿素＝100：0.05～0.08。尿素含氮46％。玉米中含蛋白质约为8.5％。***培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途径。不同的微生物菌种、不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的，即使是同一微生物在不同的培养阶段，对培养基的碳氮比的要求也是不一样的。3.有些产物会受氮源的阻遏避免使用阻遏性氮源。例如蛋白酶合成会受到铵盐、磷酸盐类所阻遏如构巢曲霉的蛋白酶的合成可为铵盐所阻遏。三、无机盐的微量元素作用***①构成菌体成分；②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；④作为自养菌的能源。••主要元素有P、S、Mg、K、Ca等；•微量元素有Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Co、B等。•锌、钴、锰、铜等微量元素大部份作为酶的辅基和激活剂，一般来讲，只在合成培养基中才加入这些元素。•一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料等都含有微量元素。4、无机盐的微量元素使用注意点***A.有的来源可能带有过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑。B.要避免钙盐过多时，以免形成磷酸钙沉淀。因此，当培养基中的磷和钙的浓度都很高时，可将两者分别灭菌或逐步加；C.先要将配好的培养基用碱调到pH近中性，再将碳酸钙加入培养基中，保留其缓冲力。例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml发酵罐必须进行表面处理使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，pH对酶活的影响.pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟四、生长因子、前体和产物促进剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。以谷氨酸为例生物素是B族维生素，影响细胞膜的透性***生产上常用的生物素来源的原料及其生物素含量（ug/kg）玉米浆180干酵母600～1800豆饼水解液120甘蔗糖蜜1200麸皮200米糠270甜菜糖蜜53有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。***前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136•苯乙酸及其衍生物是青霉素的前体物质。用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利.苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%.前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率.3、产物促进剂促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。五、水水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。种子培养基发酵培养基一般采用深井水或自来水。第二节培养基的类型培养基按其组成物质的纯度、状态、用途进行分类。一、按纯度合成培养基(syntheticmedium):原料其化学成分明确、稳定。适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律。培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产。天然培养基(complexmedium):采用天然原料原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产。原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性。半合成培养基(semi－syntheticmedium)采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0。YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl10g，PH7.2培养大肠杆菌常用两种培养基二、按状态固体培养基:半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:三、按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种。选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等生理代谢菌种筛选种子培养发酵培养发酵生产中的培养基类型•工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：•斜面培养基•种子培养基•发酵培养基1．斜面培养基•作用：•供给细胞生长繁殖或保藏菌种用的。斜面培养基特点：***1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。2.但对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝