花粉生活力测定方法研究进展

花粉生活力测定方法研究进展摘要：总结了花粉活力测定的染色法、离体萌发法以及田间授粉法等的原理和应用并分析了各种方法的优缺点。关键词：花粉花粉活力测定方法花粉是高等植物的雄性配子体，在有性繁殖过程中起到传递雄性亲本的遗传信息。花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象，也是孢粉分析、蜂群培育、药物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发、或发育的能力。在农业生产及农业常规杂交育种的中，研究花粉的生活力和育性是不可缺少的基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到花期不一致带来的困难，为解决这一难题，保存花粉的活力成为重要手段，而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此，掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有较高的作用和意义。综合前人的研究结果，花粉生活力的检测方法可以分为四大类：①染色法；②萌发测定法；③田间授粉检测法；④形态测定法、无机酸检测法。1染色法1.1TTC染色法TTC即2,3,5-氯代三苯基四氮唑，它是一种氧化还原染料，水溶液无色。基本原理是[1]：当TTC渗入细胞后，遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子，由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物，由此来判断花粉的生活力。具体操作步骤：①配制PH为7.17的磷酸缓冲液。称取0.832克磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾溶于100ml的蒸馏水中，调整pH为7.17。②TTC溶液配制。依据不同植物称取0.02～1.0g的TTC溶于100ml的磷酸缓冲液中，于棕色瓶中黑暗处保存。③染色。取少量花粉置于载玻片上，加上一滴TTC溶液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，然后放置于35℃的恒温箱中染色15～20min。④镜检。于10×10倍镜下观察，凡具有活力的花粉被染成红色，部分丧失活力的呈现粉红色，无色的是的或不育的花粉粒。凌春英,肖恩等的研究[2]得出常温、黑暗条件下用TTC染色12h可达到较好的观察效果，并认为TTC法是大花蕙兰和墨兰花粉活力测定便捷、有效的方法。程伟[3]在研究西南桦花粉时通过与离体培养法比较认为TTC法是快速检测西南桦花粉生活力的最适宜方法，并得出TTC的适宜pH值为7.0。胡君艳，李云，孙宇涵[4]认为TTC法测得银杏花粉的活力相对于I-KI法、过氧化物酶法，最接近离体萌发法测得的花粉活力，一种较为准确的测定银杏花粉生活力的染色法，且染色5min的效果最好。魏佳[5]在研究百子莲属五个品种的花粉活力时得出TTC法不适合百莲子属花粉活力的检测。另外该法还应用于葫芦科[6]、当归[7]、番木瓜[8]、连翘[9]、人心果[10]、一串红[11]、月季[12]等花粉活力的检测。但是该法染色后的花粉颜色差别小，有活力的花粉边缘被染成红色，中间呈现黄褐色，而无活力的花粉整个呈现黄褐色，在显微镜下不易分辨[13;14]。1.2醋酸洋红染色法醋酸洋红染色法的染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色，有活力的花粉被染成红色，部分失去活力的呈现粉红色，而无活力或不育的花粉无色[15;16]。邢虎成、揭雨成、周清明用醋酸洋红对15种苎麻花粉生活力测定时，发现只有一份的花粉活力为58%，其他的活力都在85%以上，而用离体培养得出萌发率最高的为50%，通过对比认为醋酸洋红发不适合苎麻花粉生活力的快速检测[17]。许利彩、李海真、沈火林认为醋酸洋红法不适合西葫芦花粉活力的测定[16]；郭庆、王德斌等用醋酸洋红法测定海棠藤花粉活力，所得效果不理想，可能是与海棠藤特殊的花粉块结构有关[15],该法在鸢尾属花粉上效果不明显，结果不稳定[18]。然而该法在澳洲坚果[19]、胡萝卜[20]、马铃薯[21]等花粉生活力快速检测上得到广泛的应用。2I-KI染色法I2-KI染色法的基本原理是:根据淀粉遇碘变蓝的特性,根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量,从而确定花粉粒活性的高低。但在无活力的花粉中也会存在淀粉，这就使得该法测出来的值偏高，对淀粉含量低的花粉不适用，如菊属植物[22]。秦贺兰、贾宗锴等研究[23]温室内栽培的万寿菊花粉时，发现I2-KI染色法与TTC染色法所得结果相似，综合两种方法所用试剂的特点，认为I2-KI染色法更适合万寿菊花粉活力的速测。经过研究得出，该法在防风[14]、穿龙薯蓣[13]、玉米[24]、西南桦[3]等植物花粉上的速测效果比不上其他的染色方式。另外该速测方法也在刚竹属[25]、水稻[26]、苜蓿[27]、辣椒[28]等的花粉速测上得到应用。2.1过氧化物酶染色法过氧化物酶染色法又称联苯胺染色法，是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的活力。由于有活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，所用试剂与过氧化物酶发生氧化反应而染色，有活力的花粉被染成红色，无活力的花粉则呈现黄色或无色透明。胡君艳、李云、孙宇涵等在研究[4]银杏花粉活力时，发现染色界限不明显，且染色液中的双氧水使溶液产生许多小气泡，不利于观察计数，测得结果偏低，不适合银杏花粉生活力的检测。王苗苗、唐灿明[29]在研究高温逆境对棉花花粉的影响时，得出的结论是，过氧化物酶法适合在非逆境下花粉活力的检测，而不适合检测高温逆境下的花粉活力，因为高温下花粉内的过氧化物酶活性降低。而在其他的研究中，则得出的结论是过氧化物酶法适合蒙古扁桃花粉[30]、台湾恺木花粉[31]、野生樱桃李花粉[32]的检测，该染色法优于其他的染色法，与萌发法的结果最接近。2.2MTT染色法MTT染色法是根据花粉粒中脱氢酶的活性判断花粉生活力，适用试剂是四唑盐类染料，染料的配制方法为:1%2,5-联苯四唑溴化物(MTT或噻唑兰)溶于5%蔗糖[33]。镜检时，花粉呈现蓝色表明花粉有活力。张妍[13]等比较多种方法测定穿龙薯蓣花粉的活力，得出MTT法是适宜于穿龙薯蓣花粉活力的检测。蒲高忠[34]等用该法测定桂林唇柱苣苔和百寿唇柱苣苔的花粉活力，得到明显的效果，刘黎明[35]等应用该法检测新疆野杏花粉活力，也得到同样的结果。而姜雪婷[36]等应用多种方法测定梨的43个品种，经过比较认为MTT法不适合梨花粉活力的检测，测定值显著偏高。2.3FCR染色法也叫荧光染料反应法，其基本原理是荧光染料本身不产生荧光，无极性，并能自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后，即被醋酶作用形成一种能产生荧光的极性物质—荧光素。由于荧光素不能自由地出人原生质膜，而只在细胞内积累，因此可以根据花粉产生荧光的情况来判断花粉的生活。国内这一方面的研究较少，左丹丹[33]等在总结植物花粉生活力检测方法中，得出FCR法不适合芜菁芸苔属花粉生活力、橡树花粉生活力及迷迭香花粉活力的测定。2.4FDA染色法是荧光反应法的一种，使用的荧光素为二醋酸酯，原理[1]与FCR法相同。操作方式为：(1)配制FDA母液:将2mgFD人溶于1ml的丙酮中作为保存液，贮藏在冰箱中备用。(2)配制FDA使用液:使用前将FDA母液用一定浓度的蔗糖液稀释至O.01%，蔗糖浓度决定于供试花粉本身要求的渗透压浓度,可预先试验确定一个不使花粉爆裂的最低浓度,0.5M的蔗糖浓度对许多花粉是合适的。(3)将鉴定的花粉泡浸在FDA液中，(可用凹玻璃片)，在开始1小时内，对生活的花粉，荧光强度随着时间直线增加。一般抱浸15-20分钟。(4)染色至足够的时间后，用FDA液封片。(5)镜检:在荧光显微镜下，以短蓝光合适〔激发光滤片用B(IF-490)、双分色镜用B，阻挡光滤片用0530是合适的〕。生活的花粉发出黄绿色的荧光，无生活力的花粉无荧光。生活力弱的花粉荧光弱。可用物理或化学的方法杀死的花粉作对照。许利彩[16]等曾用无机酸测西葫芦的花粉活力，得出的结论是该法不适合西葫芦花粉的检测。赵元杰研究[37]结果表明，FDA染色法法用于芒花粉初始生活力测定的结果与花粉离体萌发法的测定结果是基本一致的，此方法的分析步骤简单，效率高，适合用于花粉初始生活力的大规模普查分析，但不宜作为跟踪测定芒花粉生活力变化的方法。2.5其他方法2.5.1P-苯二胺法[38]其基本原理是,通过检测一种新的过氧化物酶的存在与否来判断花粉生活力，有活力的花粉通常被完全染成黑色。具体操作为:(1)染液的配制和保存：把一小管过氧化物酶指示剂((包括25mgp-苯二胺双盐酸和50mg邻苯二酚，Sigma390-1)和200μl3%的H2O2(用pH7.4的磷酸缓冲液配制)，加入到37℃预热的50ml稀释的Trizmal6.3缓冲液中(用Trizmal6.3浓缩液和去离子水1∶9混合)。染液在冰箱中能保存15～20d，这期间若发现染液颜色由浅棕色变为深棕色或黑色，说明染液已失效。(2)测定时，取少量37℃预热的染液滴到待测的花粉样品上，10～15分钟后观察，如果花粉变黑，说明花粉具生活力。2.5.2孔雀绿一酸性品红一桔红G混合试剂染色法该混合试剂将有活力的花粉染成红色，无活力的花粉为绿色，在试验中将少许花粉埋入染色剂中，保持湿度，在室温放置7—8h，再镜检[39]。该方法曾用在牡丹[40]、百合[39]花粉活力的检测上，但结果都偏高，随着牡丹花粉贮藏时间的推移花粉活力并没有明显的变化，甚至80℃高温处理，染色率也没有明显下降。3萌发测定法3.1离体萌发法花粉离体萌发测定花粉的活力是普遍用到的方法，检测效果最为准确，广泛地应用于各种植物中。取适量的花粉散在培养基上，在25℃气温下培养一段时间，然后再显微镜下观察花粉的萌发，一花粉管大于或等于花粉直径为标准确定花粉的活力。常用的培养基有业态和固态两种，固态培养基就是多加了琼脂，其他的成分一样。培养基的基本成分为蔗糖和硼酸，蔗糖的作用是提供渗透压和花粉管萌发时所需的能量，浓度根据不同的植物而不同，一般为10%～20%，山楂最适宜的蔗糖浓度为10%[41]，桉树的最适宜浓度是20%[42]，风信子的最浓度为15%[43]。硼酸的作用是促进花粉管的萌发，浓度不同的植物也差别较大，木麻黄的适宜硼酸浓度为250mg.kg-1[46]，金银花[47]、仙客来[48]以0.01%硼酸浓度最好，茄子则以10mg.L为适宜浓度[49]。固体培养基的组合中，对不同植物来说是不同，适合桉树花粉萌发的最佳培养基为20％蔗糖+6％琼脂+0.01%[42]；茄子适宜的培养基为O．5％琼脂+5％蔗糖+硼酸lOmg·L-1[49]；客来花粉在10％蔗糖+O．Ol％硼酸+l％琼脂的培养基上萌发率最高[48]。二细胞型花粉，一般在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可萌发，但三细胞型的花粉则需加入其他的元素才能促使花粉更好地萌发，如十字花科、菊科、禾本科。在基本培养基中加入PEG(聚乙二烯)明显提高花粉的萌发率[50]。代光明在研究菊花花粉离体萌发的培养基时，在基本培养基上加入Ca和PEG时，花粉的萌发率也得到显著地提高[51]。3.2活体萌发测定法基本原理是[52]，具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上，并且不会被漂洗掉，因此可以通过漂洗柱头和比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率。操作过程为：(1)将待测花粉人工授粉于柱头上，保证花粉与柱头充分接触，并把授粉的柱头与外界隔离以免被污染。(2)一段时间后(以具体物种而定)，将柱头取下并小心置于1%的醋酸结晶紫水溶液内。此步骤的目的是使花粉的外壁着上深紫色以易于与浅色的柱头区别开来。(3)用解剖镜对指定柱头上的花粉粒记数。(4)将该柱头用水漂洗几次后,再对其上剩余的花粉粒记数。根据公式漂洗后花粉粒数目/漂洗前花粉粒数目×100%可得出萌发率。与其他方法比较，此方法最为直接可靠，王金祥、陈良碧[53]在研究本科植物花粉活力是时就用了此方法。但是只适合于感受性柱头，并且柱头的表面性质对所测的试样也有限制，测得结果偏低。4田间授粉检测法基本原理[54]是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力。将新鲜花粉与贮藏的花粉同时授给相关的植物，观测并比较贮藏前后的结实率。孙文耕[54]在李花粉贮藏性与授粉效果的研究中，得出田间授粉的坐果率较低，新制的花粉的做过滤与贮藏的花粉存在显著差异。张照坤[55]用田间