第三章抗体

第三章免疫球蛋白分子—抗体第一节抗体的发展及其特征一、抗体的发现血清中存在一种能特异性中和外毒素的组分称为抗毒素，使细菌发生特异性凝集的组分称之为凝集素。其后将其称为抗体（antibody，Ab），将能刺激机体产生抗体的物质称为抗原（antigen）。二、抗体的理化性质40年代初期Tiselius和Kabat用肺炎球菌多糖免疫家兔，证实了抗体活性与血清丙种球蛋白组分相关。图1.兔血清电泳分离图2.不同类免疫球蛋白的电泳分离离心常数7Sγ(16,IgG);19S,β2(β2M,90,IgM);β2A(IgA)三、抗体的生物学活性1．抗体与抗原的特异性结合。2．抗体与补体的结合。3．抗体的调理作用。第二节免疫球蛋白的分子结构与功能一、免疫球蛋白的基本结构Porter对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。（一）轻链和重链1．轻链（lightchain，L链）214氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量为24KD，有两个由链内二硫键组成的环肽，可分为：Kappa（κ）与lambda（λ）2个亚型。2．重链（heavychain，H链）450-550氨基酸残基组成，分子量55或75KD，含糖数量不同，4-5个链内二硫键，可分为5类，μ、γ、α、δ、ε链，不同的H链与L链（κ或λ）组成完整的Ig分子。分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。（二）可变区和恒定区1．可变区（Variableregion，V区）L链N端1/2处（VL）108-111个氨基酸残基，H链N端1/5-1/4处（VH）118个氨基酸残基，V区有一个肽环65-75个氨基酸残基。高变区（hypervariableregion,HVR）可变区骨架区（frameworkregion,FR）VL的HVR在24-34，50-56，89-97氨基酸位置。VH的HVR在31-35，50-56，95-102氨基酸位置。分别称为VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3。高变区为抗体与抗原的结合位置，称为决定簇互补区（complementarity-determiningregion,CDR），VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3具有更高的高变程度，H链在与抗原结合中起重要的作用。2．恒定区（constantregion，C区）L链C端1/2处，105个氨基酸，H链C端3/4-4/5处，331-431个氨基酸。在同一种属动物中是比较恒定的,是制备第二抗体进行标记的重要基础。（三）功能区链内二硫键折叠成球形区称为功能区（domain）约由110个氨基酸组成。氨基酸的顺序具有高度的同源性。1．L链功能区：2个，（VL，CL各一个）2．H链功能区：IgG，IgA，IgD，4个（V区1个，C区3个）IgM，IgE，5个（V区1个，C区4个）3．功能区的作用：（1）VL和VH是抗原结合的部位（FV区）。（2）CL和CH上具有同种异型的遗传标记。（3）CH2具有补体结合点。（4）CH3具有结合单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B细胞，NK细胞，Fc段受体的功能。4．铰链区（hingeregion）位于CH1和CH2之间为非独立功能区。（1）当VL，VH与抗原结合时，此区发生扭曲，使抗体分子上两个抗原结合点更好地与两个抗原决定簇发生互补。（2）因CH2和CH3构型变化，显示出活化补体，结合组织细胞等生物学活性。（四）J链和分泌成分1．J链（joiningchain）：存在于IgA，IgM中，在其组成和体内转运中具有一定作用。2．分泌成分（secretorycomponent，SC）：分泌成分是IgA上的一个辅助成分，对抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解具有重要作用。（五）单体，双体，五聚体1．单体：由一对L链和H链组成的基本结构2．双体：分泌型的IgA由J链连接的两个单体3．五聚体：是由J链和二硫键连接的五个单体IgGIgAIgM（六）酶解片段1．木瓜蛋白酶（papain）水解片段（1）裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）（2）裂解片段，2个Fab（54KD），一个Fc（50KD）Fab与抗原结合，不发生凝集反应。2．胃蛋白酶（pepsin）水解片段（1）裂解部位，铰链区H链间二硫键（N端）（3）裂解片段，F（ab’）2，无Fc片段与抗原结合可发生凝集反应二、免疫球蛋白的分子功能（一）特异性结合抗原Ig最显著的生物学特点就是能够特异性地与抗原结合，这种特异性结合抗原特性是由其V区（HVR）的空间构型决定的。Ig的抗原结合点由L链和H链超变区组成，与相应抗原上的表位互补，借助静电力，氢键以及范德华力等次级键相结合，这种结合是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的影响。不同的抗原可能有相同的抗原决定簇，一种抗体可以与两种或两种以上的抗原发生反应，此称为交叉反应（crossreactoion）。（二）活化补体1．IgM，IgG1，IgG2和IgG3可通过经典途径活化补体。2．IgA1，IgG4，IgE等可以通过替代途径活化补体。（二）活化补体3．IgM，IgG1，IgG2和IgG3可通过经典途径活化补体。4．IgA1，IgG4，IgE等可以通过替代途径活化补体。（三）结合Fc受体不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体（FcγR，FcεR，FcαR），当Ig与相应抗原结合后，由于构型改变，促使Fc同相应的细胞结合。由IgE抗体Fc段的结构特点，可在游离情况下与细胞受体结合，称为亲细胞抗体（cytophilicantibody）。1．介导I型变态反应IgE诱导的细胞脱颗粒，释放组胺，合成由细胞质来源的介质，如：白三烯，前列腺素，血小板活化因子等引起的I型变态反应。2．调理吞噬作用调理作用（opsonization）是指抗体，补体等调理素（opsonin），促进吞噬细胞吞噬细胞等颗粒性抗原。由于补体对热不稳定，称热不稳定调理素（heat-labileopsonin），抗体又称为热稳定调理素（heat-stableopsonin）。抗体的调理机制：①在抗原和吞噬细胞之间搭桥。②改变抗原表面电荷。③中和细菌表面的抗吞噬物质。④溶化吞噬细胞（抗原抗体复合物结合细胞表面Fc受体）5．发挥抗体依赖的细胞介导细胞毒作用（antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）（二）通过胎盘IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的Ig。是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿的抗感染有重要作用。三、免疫球蛋白分子的抗原性（一）同种型同种型（isotype）指同一种属内所有个体共有Ig抗原、特异性的标记，在异种体内可诱导产生相应的抗体，同种型的抗原性主要位于CH和CH上，同种型主要包括Ig的类、亚类、型和亚型。1．免疫球蛋白的类和亚类（Classesandsubclasses）（1）类，决定Ig不同类的抗原性差异存在于H链的恒定区（CH）。（2）亚类，同一类Ig中，存在于铰链区氨基酸组成和二硫键数目的差异。2．免疫球蛋白的型和亚型（typesandsubtypes）（1）型，决定Ig型的抗原性差异存在于L链的恒定区（CL）。（2）亚型，按λ铰链恒定区（C2）个别氨基酸的差异又可分为λ1，2，3，4，四个亚型。（二）同种异型同种异型（allotype）是指同一种属不同个体的Ig分子抗原性的不同，在同种异体间免疫可诱导免疫反应。1．λ链上的同种异型（重链上）。2．α2链上的同种异型。（三）独特型独特型（idiotype）为每一种特异性IgV区上的抗原特异性。四、免疫球蛋白分子的超家族许多细胞膜表面和机体某些蛋白分子，其多肽链折叠方式与Ig折叠相似，在DNA水平上和氨基酸序列上与IgV区或C区有较高的同源性，它们可能从同一原始祖先基因经复制突变衍生而来。编码基因称为免疫球蛋白基因超家族，基因表达产物称为免疫球蛋白超家族(Immunogloblinsuperfamily,IGSF)。抗原识别受体，信号传导因子，MHC相关分子，Ig受体等第三节各类免疫球蛋白的生物学活性IgGIgAIgMIgDIgE重链名称γαμδε重链功能区数目44545主要存在形式单体单体双体五聚体单体单体分子量(KD)146-170160;400970175188碳水化合物（%）410121812血清浓度(mg/dl)1150±300210±501500.3-40.002血清总IgG(%)75105-1010.001外分泌液-++++--经典途径活化补体++-+++--代替途径活化补体++?++半衰期（天）20-235.85.12.82.5合成部位脾淋巴浆细胞粘膜淋巴组织脾淋巴浆细胞扁桃体脾浆细胞粘膜浆细胞通过胎盘+----第四节免疫球蛋白基因的结构和抗体多样性1965年，Dreyer和Bennet首先提出Ig的V区和C区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中，这两个基因发生易位而重排在一起。1976年日本学者根川应用DNA重组技术证实了这一假说，1987年获得诺贝尔医学和生理学奖。Ig分子是由三个不连锁的Igκ，Igλ和IgH基因所编码的，分别位于不同的染色体上。编码多肽链基因符号基因染色体定位人小鼠κ轻链λ轻链重链IgκIgλIgH2221461612一、Ig重链基因的结构和重排（一）重链V区基因H链V区基因是由V，D，J三种基因片段经重排组成，首先发生D与J基因片段的连接形成D—J，然后再与V片段连接，是通过七聚体—间隔序列—九聚体识别信号和重组酶而完成的。（二）重链C区基因1．C基因片段小鼠H链区基因片段从5′端到3′排列的顺序是Cμ—Cδ—Cγ3—Cγ1—Cγ2b—Cγ2a—Cε—Cα，人H链C区基因的顺序为Cμ—Cδ—Cγ3—Cγ1—Cε2（Psendo基因）—Cα1—Cγ2—Cγ4—Cε—Cα2。（三）膜表面Ig重链基因膜表面Ig（SmIg）是B细胞识别抗原的受体。二、Ig轻链基因的结构和重排在IgH链基因重排后，L链可就区基因片段随之发生重排。在L链中，κ链基因先发生重排，如果κ基因重排无效，随即发生λ基因的重排。L链的CDR1，CDR2和大部分CDR3由Vκ或Vλ基因片段所编码，Jκ或Jλ基因片段编码CDR3的其余部分和第四个骨架区。L链无D基因片段。三、抗体多样性的遗传基础机体对外界是环境中种类众多抗原刺激可产生相应的特异性抗体，推算抗体的多样性在107以上。多肽链基因片段数V区基因重组方式重排和随机配对后推算的多样性数目VDJH链κ链1000124250-4V—D—JV—J4.8×1044.8×1071.0×103*多样性数目不包括VDJ连接多样性，N区插入和体细胞突变所增加的多样性数目。第五节抗体的制备一、多克隆抗体（ployclonalantibody，第一代抗体）天然抗原物质往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体，一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。在机体淋巴组织内可存在多种抗体形成细胞（B细胞），当受刺激后，对应一个抗原决定簇，每种B细胞可增殖化化为一种细胞群（克隆Clone），并分泌合成在理化性质，分子结构，遗传标记，以及生物学特性等方面相同的均一性抗体（单克隆抗体），多种抗原决定簇可刺激多种细胞克隆合成分泌各种不同的抗体（多克隆抗体）。二、单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb，第二代抗体）1975年德国学者Kohler和美国Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞（sheepredblootcell）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成的部分杂交瘤细胞（hybridoma），既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。它们是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体。三、基因工程抗体（第三代抗体）目前大多数单克隆抗体是鼠源的，在临床应用上受到限制，80年初，人们开始对Ig基因结构功能研究的深入，