第三章沉淀技术.

沉淀技术第三章沉淀技术第一节蛋白质沉淀的基本原理第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用第一节蛋白质沉淀的基本原理一、蛋白质的溶解性蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所组成的两性高分子聚合物，溶解性是由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面大部分是亲水的，而其内部大部分是疏水的(见图4-1)，亲水和疏水区域的分布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理pH值条件下，如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面同时存在，则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。分子量的大小对蛋白质的溶解度也会有影响，通常情况下分子量小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解。第一节蛋白质沉淀的基本原理另外，蛋白质的溶解度同样也取决于所处环境的物理化学性质。影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。但是在同一特定的外部条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于溶质本身的分子结构。如分子所带电荷的性质和数量、亲水与疏水基团的比例及两种基团在蛋白质分子表面的排列等。第一节蛋白质沉淀的基本原理二、蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相，水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体系统，但是它的分散相质点是分子，它是蛋白质分子与溶剂（水）所构成的均相系统，分散程度以分散相质点的半径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于1nm～100nm的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和形状的观测知道，其分子的大小已达到胶体质点1nm～100nm范围之内，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的性质等。第一节蛋白质沉淀的基本原理球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明，每一克蛋白质约可以结合0.3g～0.5g的水，使蛋白质分子表面形成一层水膜，称水化膜。蛋白质分子表面具有许多可解离的基团，因此在一定的pH条件下，能与其周围电性相反的离子形成所谓双电层。由于水化层和双电层这两种稳定的因素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化膜和双电子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。第一节蛋白质沉淀的基本原理三、沉淀动力学溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动（布朗运动）；②对流运动，由机械搅拌产生；③差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中①和②两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第3种机理在沉降过程中起主导作用（如在废水处理中）。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同向聚集。第一节蛋白质沉淀的基本原理沉淀剂的性质和浓度，加入蛋白质溶液的方式，反应器的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚集体的数量与大小。沉淀剂的加入可快可慢，可以溶液形式也可以固体形式加入（如硫酸铵）。在搅拌式反应器或管式反应器或活塞式流动反应器中，它们的混合情况各不相同，因此沉淀剂和蛋白质溶液之间的接触状况在这些反应器中很不相同，得到的絮体或聚集体的性质也不相同。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用一、基本方法蛋白质的沉淀有可逆和不可逆沉淀两种。蛋白质发生沉淀后，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态，这就是蛋白质的可逆沉淀。重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等也可使蛋白质发生沉淀，但不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀。生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：盐析法（中性盐沉淀）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、金属离子沉淀法。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用1．盐析法（中性盐沉淀）盐析法中常用的中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4等。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶”；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称“盐析”。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，可恢复蛋白质的活性。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。盐析法突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用（1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。图4-2为盐析示意图。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用图4-2蛋白质盐析原理示意图第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用（2）中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是（NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：①溶解度大，尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0℃～4℃）进行。②分离效果好。有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。③不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用（2～3）mol/L的(NH4)2SO4保存可达数年之久。④价格便宜，废液可以肥田不污染环境。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用（3）盐析的操作方法在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量见下表。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数。（4）盐析曲线的制作如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。硫铵沉淀曲线0510152025300%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%硫酸铵饱和度（%）酶活（U/ml）第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用（5）盐析的影响因素有关影响盐析的因素如下所述。①蛋白质的浓度中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25mg/mL～30mg/mL。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用②pH值对盐析的影响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。③温度的影响温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用2．有机溶剂沉淀法（1）基本原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用有机溶剂沉淀法的优点是：①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。（2）有机溶剂的选择和浓度的计算有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V=V0(S2－S1)／(100－S2)(4-1)式中V——需加入100％浓度有机溶剂的体积，mL；V0——原溶液体积，mL；S1——原溶液中有机溶剂的浓度，g/100mL；S2——所要求达到的有机溶剂的浓度，g/100mL。100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2)项应改为(95－S2)。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。（3）有机溶剂沉淀的影响因素有关影响有机溶剂沉淀的因素如下所述。①温度多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度（-10~-20℃），操作要在冰浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用②样品浓度样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即