第三章细胞工程.

第3章细胞工程动物的细胞与组织培养定义：从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理环境，在体外建立无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。1动物细胞培养群体培养（massculture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层克隆培养（clonalculture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。群体培养（左）和克隆培养（右）原代培养（primaryculture）：即细胞或组织离开机体后的首次培养。primaryculture-startedfromcells,tissuesororganstakendirectlyfromananimal传代（passage）：培养的细胞生长到一定的密度后转移到新的容器中培养或需要更换到新的培养液称为传代或传代培养。subculture-thetransplantationofcellsfromoneculturetoanother(passaging)细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系。如果可以连续传代则称为连续细胞株。原代培养细胞成功传代即为细胞系。cellline-arisesfromtheprimarycultureatthetimeofthefirstsubculture-finitelifespancontinuouscellline-acelllinewhichhasbeentransformed-infinitelifespan细胞株（cellstrain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。2发展历史动物细胞（组织）培养技术起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。Harrison--isolatedpiecesoffrogembryonictissueknowntogiverisetonervefibres-grewtheminfroglymph-observedoutgrowthofaxonsoverperiodofweeksin1907.法国学者Carrel1923年设计的卡氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持34年之久,特别注意到实验中的无菌操作。实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2／0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin19513.1.1动物细胞的特点与微生物、植物细胞相比，动物细胞有哪些特殊之处？动物细胞与微生物细胞相比，主要有以下不同：（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。（3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。（4）动物细胞间主要以聚集体形式存在。（5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。3.1.2体外培养原代培养（亦称初代培养）传代培养（亦称继代培养）。PrimaryCultureretentionofthe3Dshapeoutgrowthandmigrationofcells解剖分离解聚离体培养3.2.1体外培养的条件3.2.1.1与微生物细胞培养相比动物细胞培养的特殊性大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节pH。培养条件TemperaturepHDissolvedgasNutrients天然培养基动物血清、组织提取液、鸡胚胎提取液等优点：营养价值高缺点：成分复杂、来源有限、成本较高小（胎）牛血清——蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、多种生长因子等成分。合成培养基Earle于1951年首次使用。优点：成分已知、易控制缺点：无法替代一些未知成分解决途径——合成培养基中添加小牛血清，彼此互补无血清培养基血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的成分血清培养基缺点：对后期产物的分离、提纯及检测造成干扰。来源有限、成本较高无血清培养基：试图全部替代血清成分，尤其是生长因子（例如胰岛素）、激素（例如生长激素）等。培养过程图解细胞系生长过程的3个主要阶段（一）原代（初代）培养期指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。组织和细胞刚离体，生物学特性变化不大，具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，很适合做药物测试，细胞分化等实验研究。（二）传代期原代培养细胞一经传代后便称为细胞系，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代10-50次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。（三）衰退期该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。22动物细胞融合1958年，日本冈田善雄意外发现经UV灭活的仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合；1960年，法国Barski发现两种不同类型细胞混合培养会自发形成融合细胞；1965年，冈田善雄等采用灭活的仙台病毒融合产生第一个动物种间异核体；1966年，Yerganian用相同的方法获得能增殖的杂种细胞；单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。动物组织细胞培养要求一体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。二培养工具:•培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。细胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。•根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。••三、培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。•【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度:37℃，•维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；•人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；•在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；•41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；•当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低2）PH：7.2-7.４•当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色--pH7.4，•橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。3)气体：•ＣＯ２有调节PH的作用。•气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养—培养基：•在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。•动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。合成培养基•1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。•人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。天然培养基•直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。•血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。•常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。•氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。•水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。无血清培养基•动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。5)细胞培养溶液•平衡盐水（BSS）：Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液。