第三章色谱知识导论09-26

1第三章色谱知识导论色谱分析是从分离技术发展而成为分离-分析技术的一门综合性学科，是一种物理化学的分析方法。它是将待分析的混合各组分在两相中进行分离，然后顺序检测各组分含量的方法。3.1色谱分析的历史、定义及分类3.1.1历史1906年，俄国植物学家茨维特（M.Tswett）首先提出了色谱法，茨维特经典实验如下：通过实验，茨维特成功的分离了树叶的石油醚萃取液中的各种色素，得到了不同因素的谱带。所得的谱带中最下面的色谱带呈黄色，经分析为胡萝卜素。随后是另一黄色的叶黄素谱带，上面两层是呈棕色和黄绿色的叶绿素a、叶绿素b谱带。由于不同色谱带有不同的颜色，故此分离方法称为色谱法色层法（chromatography）。虽然后来色谱的发展不限于分离有色物质，更多用于无色物质的分离及测定，由于习惯，现在仍沿用色谱这个名称。在茨维特经典实验里，溶于流动相(石油醚)中的样品(植物色素)各组分经过固定相(CaCO3)时，其与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等相互作用，且其作用的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留的时间也不同，从而先后从固定相中流出，实现了不同组分的分离。当分离后的组分由流动相携带进入检测器时，就得到了一个一个的色谱峰。茨维特经典色谱分离速度慢，分离效率低，一直没有引起足够的重视。1941年Martin和Synge把氨基酸的混合液注入到以硅胶做固定相的柱中，用氯仿做流动相，将各个氨基酸的组分分开，这才引起了化学家的重视。1944年Martin和Synge用滤纸代替硅胶，不用色谱柱，固定相是滤纸中含有水分的纤维素，流动相用有机溶剂，也成功的分离了氨基酸，从而建立了纸色谱法(paperchromatography)。1952年，Martin等又提出了给挥发性化合物的分离测定带来划时代变革的气相色谱法(gaschromatography)，因而获得了当年的诺贝尔化学奖。20世纪50年年代又出现了将固定相涂在玻璃板上的薄层色谱法（thin-layerchromatography）。现在，高效液相色谱及计算机技术的发展，使现代色谱进入了一个迅速发展的新时代-智能色谱（chromatographywithartificalintelligence）。是色谱法在现代分离分析技术中占用极其重要的地位。3.1.2色谱的定义由茨维特经典实验可知：色谱法是一种物理的分离方法。其利用固定相与被分离的各组分产生的吸附2（或分配）作用的差别，被分离的各组分在固定相中的滞留时间不同，使不同的组分按一定的先后顺序从固定相中被流动相洗脱出来，从而实现不同组分的分离，再进行定性定量分析。色谱分析操作时，不会损失混合物中的各个组分，不改变原有组分的存在形态，也不会生成新物质。3.1.3色谱法的分类按两相的状态可分为：流动相液体气体固定相固体液体固体液体名称液固色谱液液色谱气固色谱气液色谱总称液相色谱气相色谱按固定相的性质可分为：固定相性质柱纸薄层板固定相形式填充柱开口管柱具有多孔和强渗透能力的滤纸或纤维素薄膜玻璃板在管内填充固体吸附剂吸附在内壁的毛细管操作方式从柱头向柱尾连续冲洗从滤纸中央向四周扩散从一端向另一端扩散名称柱色谱纸色谱薄层色谱按分离过程的物理化学原理分：名称吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱原理利用吸附剂对不同利用固定液对不同利用离子交换剂对利用凝胶对不同组3组分吸附性能的差别组分分配性能的差别不同离子亲和能力的差别分分子的阻滞作用的差别平衡常数吸附系数KA分配系数KP选择性系数KS渗透系数KPF流动相为液体液固吸附色谱液液分配色谱液相离子交换色谱液相凝胶色谱流动相为气体气固吸附色谱气液分配色谱3.2色谱图及相关术语3.2.1色谱图色谱图是指色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图。3.2.2色谱相关术语①基线：在实验操作条件下，只有纯流动相通过检测器时记录下的信号-时间曲线，它反应了仪器噪声随时间的变化。稳定的基线应是一直线，若是斜线则称为基线漂移，如基线上下波动则称为噪声。②色谱峰色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，每个色谱峰代表样品中的一种组分，理想的色谱峰应为对称的正态分布曲线。③峰高和峰面积峰高h：峰顶到基线的距离。峰面积A：组分流出曲线与基线间所包围的面积。④峰拐点：二阶导数为零的点。⑤峰宽和半峰宽峰宽Wb：两侧拐点处所做的切线与峰底相交两点之间的距离。半峰宽：在峰高为h/2处的峰宽。⑥保留值死时间tm：是不被固定相滞留组分（即惰性组分）从进样制出现浓度极大点时的时间，也是流动相流过色谱系统所需的时间。死体积Vm：对应于死时间所需的流动相体积。Vm=tm•FcoFco—流动相体积流速（ml•min-1）保留时间tR：组分从进样到出现色谱峰顶点时所需的时间。保留体积VR：对应于保留时间所消耗的流动相体积。VR=tR•Fco调整保留时间tR’：tR’=tR-tm调整保留体积VR’：VR’=VR-Vm=tR•Fco-tm•Fco=（tR–tm）•Fco=tR’•Fco相对保留值r21：r21=tR2’/tR1’=VR2’/VR1’。相对保留值越大，选择性越好，越易分开。选择因子α：选择前一个峰的调整保留值tRs’为基准，求其它后出峰组分i对基准峰的香桂保留值。α=tRi’/tRs’=VRi’/VRs’3.3色谱分析的基本理论3.3.1分配平衡①分配系数K在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间的分配达平衡时的浓度之比。K=（溶质在固定相的浓度）/（溶质在流动相的浓度）=Cs/Cm②分配比k在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间的分配达平衡时的质量之比。k=（溶质在固定相的质量）/（溶质在流动相的质量）=ms/mm=（Cs••••Vs）/（Cm•Vm）=K•Vs/Vm=K/ββ=Vm/Vs称为相率比，是柱型特点参数。③保留比Rs与分配比k的关系4组分在柱内的平均线速率uL与相同条件下流动相在该柱内的平均线速率的比值为保留比。Rs=uL/u，而uL=柱长/tR=L/tR，u=柱长/tm=L/tm故Rs=tm/tR用组分在流动相中的质量分配比例系数表示时，保留比Rs为Rs=（组分在柱内流动相中的总质量）/（组分在柱内流动相和固定相中的总质量）=mm/(mm+ms)=1/(1+k)可得出：tR=tm•（1+k）④分配比k，分配系数K与选择因子α的关系：α=tR2’/tR1’=VR2’/VR1’=k2/k1=K2/K13.3.2色谱柱的总分离性能以上两张谱图k，,α值完全相同，仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。直观的看，峰的尖锐程度代表了柱效高低，峰越尖锐，其柱效越高，通常使用理论塔板数（n）的大小衡量柱效的高低。色谱柱的总分离效能指标—分离度R。分离度R越大，两组分的分离程度越高。R=1.0时，分离效率达98%。R1.0时两峰部分重叠。R=1.5时，分离程度达99.7%。)(2121)1()2(WWttRRR5R1.5可以得到基线分离分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度R太小，两个峰无法彻底分离R太大，分离时间过长，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行业特殊规定3.4色谱的定性、定量分析3.4.1色谱定性分析一般不能从色谱图中给出定性结果，而需要与已知物对照，或利用色谱文献数据或其它分析方法配合才能给出定性结果。①利用已知物定性。利用已知物定性包含3个方面：用保留时间或保留体积定性；利用峰高增加法定性；利用双柱或双系统定性。②与其它分析仪器结合定性。实现联机的条件有：样品池体积足够小，分析速度足够快，分析的灵敏度足够高，检测限低。目前常见的色谱与其他分析仪器连接的技术主要有：色谱-质谱联用，色谱-红外光谱联用。3.4.2色谱定量分析色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有mi=fi’•Ai，其中fi’是绝对质量校正因子，Ai是峰面积。定量要解决的问题有：峰面积的测量和计算；校正因子的测量与计算；色谱定量方法及其应用。①校正归一化法归一化法优点：不必知道进样量；此法较准确，仪器及操作条件稍变对结果影响不大；比内标法方便，特别是需分析多组分时；如fi’相近或相同时，可简化为面积归一化法。面积归一化法②内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。100100100%221121’‘’‘nniiniiifAfAfAfAmmmmmmC%100%iiiiiAfAfC’‘%100%iiiAAC6③外标法（标准曲线法）用于常规分析④单点校正当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。ssiisiAfAfmm‘’1001001100%,sississsiiiifmmAAmAfmAfmmC‘’‘%100%ssiiCAAC