苏教版教学教案考点6多聚酶链式反应扩增DNA片段

新沂一中2010届第二学期高三生物一轮复习教学案017选修一多聚酶链式反应扩增DNA片段【学习目标】1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用【知识梳理】一、PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：1．1细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3’端起点1．2细胞内DNA复制过程（1）DNA的反向平行结构：由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，DNA双螺旋结构的反向平行结构：（2）DNA的复制过程:解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。1．3DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程变性复性延伸变性：在95℃时DNA解旋复性：在50℃时引物与DNA单链结合延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）2．实验操作2．1PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水2．2实验操作步骤2．3按照PCR反应体系配方配制反应液；（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；（3）将微量离心管放到PCR仪中；（4）设置PCR仪的工作参数。（5）DNA在PCR仪中大量扩增。2．4水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3．实验注意事项3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4．结果分析与评价4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数（三）课堂总结、点评【例题分析】【例1】在（）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开A.10－20℃B.80－100℃C.20－30℃D.40－60℃【例2】关于DNA的复制，下列叙述正确的是（）A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算【例3】下列有关PCR描述，不正确的是（）A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增产量按y＝（1＋X）nD.扩增对象是氨基酸序列E.扩增对象是DNA序列【基础检测】1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（）A仅一条作为复制模板B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（）①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构A①③④②⑤B①④②⑤③C①③⑤④②D③①④②⑤3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（）①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录A①②③④⑤B①②③④C①②③⑤D①③④⑤4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（）①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度A①②③④⑤⑥B②③④⑤⑥⑦C②③④⑤⑦⑧D①②③④⑦⑧5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（）A2B4C8D16，6.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（）A215B230C260D2317.DNA的合成方向总是（）延伸。A从DNA分子的左端向右端B从DNA分子的右端向左端C从子链的5，端向3，端D从子链的3，端向5，端8.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（）A氧气的浓度B酸碱度C温度D大气的湿度9.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（）A模板母链相同B非模板母链相同C两条模板母链相同D两条模板母链都不相同10、将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为。（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。新沂一中2010届第二学期高三生物一轮复习教学案017选修一多聚酶链式反应扩增DNA片段答案【例题分析】解析1：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。答案：B【例2】解析：由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。答案：C【例3】解析：PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝，其扩增产量为y＝（1＋X）n，y代表DNA片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选D。答案：D【基础检测】答案：1-5CDADA6-9BCCB11：（1）耐高温2）引物对B（3）否（4）农杆菌（5）①2②1【课后阅读】免疫-PCR免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.免疫PCR优点为:①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.