第二章微生物发酵产酶.

Chapter2TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物发酵产酶制作：崔建东[e-mail]21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物3、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生产过程的动力学GoGoGoGo酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample微生物发酵产酶酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。大多数酶的生产采用发酵生产→原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点微生物发酵产酶优良的产酶微生物具备的条件：（1）酶的产量高；（2）产酶稳定性好；（3）容易培养和管理；（4）利于酶的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。微生物发酵产酶酶的发酵生产的方式：固体培养发酵液体深层发酵固定化微生物细胞发酵固定化微生物原生质体发酵微生物发酵产酶酶生物合成的基本理论蛋白类酶和核酸类酶→酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程.合成过程:酶的基因（DNA）→（转录）→RNA→（翻译）→多肽链→（加工、组装）蛋白质酶生物合成过程ThebiosynthesisprocessofEnzyme1、中心法则-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白质的生物合成-Translation4、酶生物合成的调节-RegulationGoGoGoGoReversetranscription1、中心法则-CentralDogma2、RNA的生物合成(转录)-Transcription细胞内RNA的生物功能在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。3、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译:以RNA中mRNA为模板,按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程.mRNA蛋白质翻译各种信息各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出的操纵子学说（Operontheory）来阐明的。酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述操纵子（Operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因。酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述启动基因（Promotergene）：由两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclicAMP,cAMP）与CAP组成的复合物(cAMP-CAP)的结合位点。操纵基因（Operatorgene）：与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述调节基因（Regulatorgene）:产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法进行。酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述结构基因（Struturalgene）：结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述诱导型操纵子（Inducibleoperon）—大肠杆菌乳糖操纵子酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述阻遏型操纵子（Repressibleoperon）—色氨酸操纵子(Trpoperon)色氨酸操纵子(tryptophaneoperon)负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。酶生物合成的调节真核生物酶生物合成的调节目前为止，还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction1、细菌细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction1、细菌细菌属于真细菌纲(Schizomycetes)，是单细胞，横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction球菌链球菌常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction四联球菌葡萄球菌常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction杆菌螺旋菌(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等(2)醋酸杆菌（Acetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）、葡萄糖异构酶(高果糖浆)、山梨糖(维C中间体）(3)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。常用的产酶微生物放线菌(actinomycetes)放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(Streptomyces)。链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径0.2～1.2μm。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可用于甾体转化。常用的产酶微生物放线菌链霉菌属诺卡氏菌属常用的产酶微生物放线菌诺卡氏菌属多为需氧型腐生菌，少数厌氧型寄生菌。已报道有100余种，主要分布于土壤。许多种能产生抗生素，如利福霉素（rifomycin）等，有的用于石油脱蜡，烃类发酵及污水处理等。常用的产酶微生物放线菌链霉菌属主要分布于含水量较低，有机质丰富的中性或微碱性土壤中，多数为腐生，好氧菌。已知放线菌所产抗生素的90％由本属产生。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction2、霉菌霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。曲霉(Aspergillus)分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。回本节常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction黑曲霉黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，α-淀粉酶,酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，核苷酶等。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction米曲霉(Aspergillusoryzae)米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2mm左右，粗糙。米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction红曲霉（Monascus）红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊壳内。红曲霉可用于生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。青霉菌种类很多，其中产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）用于生产葡萄糖