第二章蛋白质化学-蛋白质的结构.

2019/12/19生物化学Biochemistry第二章蛋白质protein第三节蛋白质的结构TheStructureofProtein•自然界中存在的蛋白质大约有1010~1012种，不同的蛋白质具有不同的结构，那么，由20种氨基酸如何组成了数目繁多、结构各异的蛋白质大分子呢？20世纪50年代初，首先认识到蛋白质具有不同的结果层次，并引入了一级、二级、三级结构的概念。•蛋白质的分子结构包括•一级结构(primarystructure)•二级结构(secondarystructure)•三级结构(tertiarystructure)•四级结构(quaternarystructure)定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸序列。包括下面几个方面的内容：一、蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。（1）组成蛋白质的多肽链数目；（2）多肽链的氨基酸顺序；（3）以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。蛋白质分子不是简单的一条肽链，有的呈环状，有的是几条肽链组成，其中二硫键是连接肽链间的主要桥键。二硫键在蛋白质分子中起着稳定肽键空间结构的作用，往往与生物活力有关，当二硫键破坏，蛋白质或多肽的生物活力就消失。蛋白质肽链中和肽链间二硫键示意图一级结构被完全测定的蛋白质越来越多，如：胰岛素、血红蛋白、肌红蛋白、烟草花叶病毒蛋白等。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。(一)肽(peptide)•1、肽键和肽•肽键(peptidebond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。•肽：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽，以此类推。NH2-CH-CHOOH甘氨酸NH2-CH-CHOOH甘氨酸NH-CH-CHOHOOH甘氨酸+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO肽键结构二肽•寡肽(oligopeptide)：由十个以内氨基酸相连而成的肽。•多肽(polypeptide)：由是个以上的氨基酸相连形成的肽，也叫多肽链(polypeptidechain)。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。•蛋白质:由一条或几条多肽链组成的生物大分子•氨基酸残基(aminoacidresidues)：蛋白质肽链中的每个氨基酸部分。•多肽主链：由肽键连接各氨基酸残基形成的长链骨架•多肽侧链：蛋白质多肽链中的各氨基酸侧链基团2、肽键的性质1)肽键比一般C-N键短，比C=N长，因而具有部分双键性质，故不能自由旋转2)肽键原子及相邻的碳原子（共6个原子）在同一平面上，组成刚性的肽平面。3)相邻的碳原子呈反式构型。CNCHNCOC0.123nm0.132nm0.153nm0.147nmC-N:0.149nmC=N:0.127nm肽键：0.132nm肽键比一般C-N键短肽键为一平面相邻的碳原子呈反式构型3、肽的命名及结构•1、根据所含AA数目：二肽、三肽、四肽等•2、根据来源和功能：如，脑啡肽、短杆菌肽S等。•3、肽结构：自然界中存在的肽有开链式结构和环状结构。环状结构中没有游离的氨基末端和游离的羧基末端，微生物中常见，如，短杆菌肽S。R1R2H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCONHCHCOOHR3R4RnN端C端氨基酸残基4、多肽链的表达式N端：有自由氨基的一端C端：有自由羧基的一端多肽链的表示方法：从N端开始到C端可用aa中文第一个字或英文连字体或单字母中间用“·”或”-”连接多肽链的方向性：Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端N末端C末端牛核糖核酸酶（二）体内存在多种重要的生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH与GSSG间的转换•体内许多激素属寡肽或多肽•神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽(三)蛋白质一级结构的测定•(1)组成蛋白质的多肽链数目(2)多肽链的氨基酸种类、数目及排列顺序;(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质高级结构及其生物功能的基础。要求•样品必须是均一的。纯度在97%以上•知道蛋白质的相对分子质量蛋白质一级结构测定的原则将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。1955年，英国生物化学家桑格（Sanger）首先完成了牛胰岛素一级结构的分析，为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定拆开二硫键纯蛋白质蛋白质序列测定的基本战略1、确定蛋白质中多肽链的数目•测定蛋白质末端残基（C-端或N-端），看蛋白质的摩尔数与末端残基的摩尔数的比例，若相等，则蛋白质分子只含一条多肽链；如果后者是前者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链组成。2、拆分蛋白质分子中的多肽链由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。（1）非共价键连接：若多肽链（亚基）是借助非共价键相互作用缔合的，如血红蛋白四聚体，烯醇化酶二聚体，可用变性剂如8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍,SDS处理，即可分开。（2）共价键连接：通过共价二硫键交联的，则可以采用氧化剂（过甲酸氧化法-）或还原剂（巯基化合物还原法）将二硫键断裂，如胰岛素、免疫球蛋白等。（1）过甲酸氧化法-直接拆除并固定过甲酸可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0℃下进行2小时左右，使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。（2）巯基化合物还原法-先拆除后再固定常用的有巯基乙醇(mercaptoethanol)、巯基乙酸(mercaptoaceticacid)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)等。反应中需加入8M尿素或6M盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，有利于巯基乙醇作用于二硫键。为防止巯基重新氧化，可用碘乙酸、碘乙酰胺、乙腈、氨乙基等使其烷化，进行保护拆开的肽链要进行分离纯化，方法有：凝胶过滤、离子交换层析、电泳等（3）分离纯化多肽链（2）巯基化合物还原法-先拆除后再固定3、每一条肽链的氨基酸组成分析•（1）酸碱水解：6mol/LHCL或4mol/LH2SO4，5mol/LNaOH可使蛋白质完全水解。用氨基酸分析仪进行测定（或层析法）。•表示方法：每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数。或100克蛋白质中含氨基酸的克数。（2）酸碱水解的特点优点：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸缺点：Trp被完全破坏，羟基氨基酸（Ser和Thr）有一小部分被分解，同时Asn和Gln的酰胺基被水解，有NH3产生优点：不破坏Trp。缺点：水解过程中多数氨基酸遭到破坏，且产生消旋现象，所得产物是D-和L-氨基酸的混合物。此外，碱水解使精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。酸水解碱水解4、氨基酸末端分析N-末端分析（1）Sanger试剂：2,4-二硝基氟苯法（DNP、NDFB、FDNB法）（2）二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法、丹磺酰氯法）（3）异硫氰酸苯酯法（PITC法、Edman法）单肽链＋PITCPTC－多肽酸性有机溶剂中加热PTH－氨基酸＋余下的肽链抽提：用有机溶剂，层析鉴定。可连续降解几十个氨基酸残基C-末端氨基酸分析肼解法：NH2NH2还原法：硼氢化锂（LiBH4）羧肽酶法：肽链外切酶，专一、逐个降解C端AA。肼解法C末端氨基酸分析绝对避免水分子的存在，肼解过程中，Gln、Asn、Cys等被破坏，不易测出，如末端为Arg，则转变为鸟氨酸C末端氨基酸分析还原法硼氢化锂（LiBH4）α-氨基醇利用层析法进行鉴定C末端氨基酸分析羧肽酶法－主要方法羧肽酶A：能释放除Pro、Arg和Lys外的所有C-末端AA残基，但如果末端不是这三个AA，而倒数第二个是Pro时，不起作用；羧肽酶B：只水解以Arg和Lys为末端残基的肽键，但倒数第二个AA为Pro时，不起作用。5、肽链的部分降解及肽片断的分离溴化氰法（CNBr）:特异性水解对Met羧基形成的肽键羟胺法:羟胺专一裂解Asn-Gly的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。化学裂解法要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得混合物进行分离纯化。经N未端和C未端测定，确定出每一肽段的序列。酶水解法（专一性高，水解产率高）胰蛋白酶:胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）:胃蛋白酶:嗜热菌蛋白酶:NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1R1=Lys、Arg（专一性较强，水解速度快）即专一性水解Lys、Arg的羧基端形成的肽键胰蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶R1=Phe,、Trp、Tyr专一性水解芳香族氨基酸羧基端形成的肽键，若羧基端与Pro相连，则不被水解胃蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1部分水解疏水性氨基酸之间形成的肽键，最适反应pH为2~3。若R1＝Pro时，不水解。嗜热菌蛋白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1专一性水解疏水性氨基酸氨基端形成的肽键，疏水性强，水解速度快。但当R2为Pro和Gly时，或R1、R3为Pro时，抑制水解•例如，某肽链，末端分析知N-末端为Ala，C-末端为Val，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下：•A：Ala-Phe、Gly-Lys-Asn-Tyr、Arg-Trp和His-Val•B：Ala-Phe-Gly-Lys、Asn-Tyr-Arg和Trp-His-Val•推理如下：•A—1Ala-Phe•B—1Ala-Phe-Gly-Lys•A—2Gly-Lys-Asn-Tyr•B—2Asn-Tyr-Arg•A—3Arg-Trp•B—3Trp-His-Val•A—4His-Val•十肽顺序为：Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Trp-His-Val6、二硫键的定位将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置。确定原多肽链中二硫键的位置肽内或肽间是否有二硫键？采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、鉴定比较容易。作用pH在酸性范围（2左右）有利于防止二硫键发生交换反应。肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳：暴露在过甲酸蒸气中使二硫键断裂++pH6.5pH6.5例：有一个A肽：1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met；2）当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala；3）当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽；4）当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽：一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸5）当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽：一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸；问A肽的氨基酸排列顺序如何？答：Ala－Arg－Glu－phe－Met－Ser二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中多肽链自身的折叠盘绕方式，即肽链主链骨架原子的相对空间位置，与氨基酸残基侧链的构象无关。(1)形成二级结构的基础━肽键平面(peptideunit)肽键平面:肽键具有双键性质,不能自由转动，与肽键相关的6个原子形成一个平面。•肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。•组成肽键的原子处于同一平面。肽平面、肽单位肽键•肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。•在大多数情况下，以反式结构存在。CCα3Cα2Cα1CNNHHHOOR酰胺平面