第十一章-动物细胞与组织培养的基础

第十一章动物细胞与组织培养的基础目的：1、掌握动物细胞、组织、器官培养的相关概念；2、掌握动物细胞体外培养的特性；3、掌握动物细胞体外培养的方法；重点：细胞培养的方法一、动物细胞与组织培养的定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。原代培养(primaryculture)将机体取出的细胞或组织进行实效（立即）培养的过程，又称初培养。初培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。传代培养(passageculture)指从原代培养的细胞继续转接培养，又称继代培养。二、发展历史开始：1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。研究内容：细胞内代谢活动，外界对其影响，细胞间互相作用等。细胞系（cellline）初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。由原代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群即成无限细胞系。此时细胞发生了遗传突变，染色体呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制特性。细胞株（cellstrain）从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）优点•⑴理化环境可控制。•⑵细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。•⑶培养物可直接被观测。•⑷提供大量均一的细胞供制备用。•⑸便于进行人工筛选。•⑹结合电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。•广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。三、动物细胞的体外培养生长特性•根据形态特征分类•贴壁型•上皮细胞型、•成纤维细胞型、•游走细胞型、•多形细胞形。•悬浮型•悬浮在溶液中细胞贴壁过程接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。四、动物细胞、组织培养的基本技术1、体外培养的特点：（1）营养要求高；（2）适应培养环境性差；（3）生长缓慢；（4）无菌条件要求严格；2、培养工具超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管超净工作台纯化水装置天平真空泵培养器皿金属器材辅助器材•加样器•支架•离心管•冷冻管滤器CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。酶标仪微孔板震荡器培养板培养瓶3、培养条件（1）温度：最适温度为37℃。细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强。高温对细胞的威胁很大。（2）PH：最适PH为7.2-7.4之间。但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性强于偏碱性。酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。（3）气体：O2及CO2用以保证细胞体内代谢活动的进行。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，则应使用5%CO2培养细胞。（4）营养：动物细胞培养对营养的要求较高，往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子，其中很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供，在很多情况下还需加入5%～10%的胎牛或小牛血清。①天然培养基其优点是营养成分丰富、培养效果好；缺点是成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。个体差异大、来源有限，还容易发生支原体污染。天然培养基的种类主要包括生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）、水解乳蛋白、胶原等。②合成培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。合成培养基的优点是既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境，且成本低。但是，人工合成培养基缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要，只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基。③无血清培养基无血清培养基不加动物血清，在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上，在基础培养基（MEM）中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞的良好生长。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。④动物细胞培养必需的溶液a.平衡盐水（BSS）：由生理盐水和葡萄糖制成。Hanks液（HBS）和Earle液（EBS）是两种常用的BSS基础溶液。b.培养基PH调整液：HEPES氢离子缓冲剂c.细胞消化液：胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液d.抗生素溶液：青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。※双抗（青、链霉素）：终浓度为：青霉素为100单位/毫升培养液，链霉素为100微克/毫升培养液。–1）游离期–2）指数生长期–3）稳定期–4）衰退期4、体外培养细胞的生长与增殖过程培养细胞一代生长过程5、原代培养与传代培养技术•贴壁细胞原代培养：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续1－4周。将分离所得的细胞沉淀，按实验要求，用培养液配制成需要浓度的细胞悬液，接种培养瓶内，水平放置，37度，进行培养，1—2天换液一次，大部可见细胞贴壁生长。•（1）原代培养技术•a.取材分离和组织消化•组织消化法是用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。常用的消化液有胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等。•※注意：如果细胞团数超过10%，说明消化过程进行的不充分；如果细胞数少于20个/mm3或多于50个/mm3说明稀释的不当，两种情况均需重新操作。b.培养过程﹡接种、培养：依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。接种量视情况而定。﹡常规检查：细胞形态检查：状态良好的细胞应是轮廓形态不十分清晰，较透明；生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，胞内有空泡、脂滴、颗粒等出现，细胞形态不规则。细胞活力检查：以活细胞占计数细胞总数的百分比来计算。常用方法有：trypanblue（台盼蓝）或Erythrosinbluish（藻红B或称蓝光藻红）染色法、细胞克隆形成率实验、四唑盐（MTT）比色法等。营养液PH值检查：培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。污染检查：细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。如果细胞发生微生物污染时，应直接灭菌后丢弃之。（2）传代培养：原代培养与传代培养是从细胞培养的不同过程来区分的。原代培养成功以后，需要对其分离重新培养，这个过程就称为传代。〃原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。〃根据细胞生长的特点，传代方法有3种：①悬浮生长细胞传代直接吸去或离心后吸去培养上清液，用新鲜培养液悬浮细胞，1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。②半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。③贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。吸去培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入消化液，在37℃中消化约3～10分钟，待细胞开始脱落时，倒去消化液，加入新鲜培养液，悬浮和吹打分散细胞。也可以待细胞完全消化脱落，500×g离心5分钟，去除消化液，用新鲜培养液悬浮细胞。1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。(2)传代培养采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。吸去培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入消化液，在37℃中消化约3-10分钟，待细胞开始脱落时，倒去消化液，加入新鲜培养液，悬浮和吹打分散细胞。也可以待细胞完全消化脱落，500×g离心5分钟，去除消化液，用新鲜培养液悬浮细胞。1：3或1：5稀释细胞后，分瓶继续培养。