组织化学技术教程1

组织化学技术教程（内部教材，仅供参考）序言现代组织化学是介入细胞生物学、组织形态学、化学与生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科，它已渗透和应用于生命科学的许多学科。近几十年来，组织化学的发展，突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，而各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。为使广大生物医学青年教师、研究生、医学高等职业技术学校专科生及有关实验技术人员尽快掌握组织化学基本技术，作者借鉴其他兄弟院校之经验，编写了简明的组织化学技术教程。由于时间仓促，有些知识未编入其中，有待完善。书中疏漏，不妥之处，望广大读者批评指正。穆长征2003年10月第一章绪论组织化学（histochemistry）是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学，是介于这些学科之间的一门边缘科学。组织化学自出现以来，已取得了长足的发展。这与相关学科的发展是分不开的，其中细胞生物学、生物化学以及分子生物学是组织化学形成和发展的基础。一、组织化学发展简史组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应。如法国植物学家F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精过程中的碘淀粉反应；M.Perls（1867）用普鲁士蓝显示出铁；A.N.F.Millon(1844)叙述了蛋白质反应；R.Fürnrohr（1850）论述了纤维素的氯锌碘法；Klebs(1868)和H.Stuve1872)用愈创木酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在；P.Ehrlich(1885)发现了细胞色素氧化酶；R.Heidenhain(1868)指出动质（ergastoplasm）—核糖核酸是一种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F.Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选择性亲和力，分离出核染色质。自A.Bencke(1862)将苯氨染料用于组织学领域，许多研究者在组织中应用了染色反应，相继各种蛋白质被染色出来。到19世纪末，胶原蛋白染色，脂肪的苏丹Ⅲ染色以及组织中金属盐类的显色等技术方法得到发展。但是由于化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞在一定时期限制了组织化学的发展。20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E.Takamatsu（高松英雄）和G.Gomori1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazoliumsaltsmethod）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H.Scheldon和D.Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electronmicroscopeenzymehistochemistry）基础。后来A.M.Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmificationmethod）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。1950年A.H.Coons等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来P.K.Nakane，S.Avrameas和L.A.Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。随着分子生物学的发展，1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上，开始探索原位杂交技术，经过30年不断应用、完善和发展，特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域，显示出巨大的应用潜力。现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科，经过近几十年的发展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之，现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围，无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。二、组织化学技术的基本要求1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。5．反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。第二章组织化学基本理论组织化学是运用物理和化学的原理、技术研究组织与细胞内的化学成分及其反应，对这些化学成分进行定性、定位及其定量并研究其变化规律的科学。它是介于组织学、细胞学与生物化学之间的一门边缘科学。人们对生物组织的研究沿着两条主要途径发展：一条途径是对显微镜下可分辨的越来越细小的形态结构进行描述；另一条途径是着力分离和描述具有重要生物学意义的物质，如核酸、蛋白质、脂类及碳水化合物等。由此进一步了解生命活动的本质规律。两条途径的研究结果互相处近，互相补充，并在细胞、亚细胞乃至分子水平上统一起来，就形成了现代组织化学。组织化学源于组织学、细胞学和生物化学；但也有别于这些学科。组织化学与组织学不同：组织学的着眼点是组织与细胞的形态结构，组织学技术的要求是尽可能保持组织和细胞的微细结构。而组织化学的着眼点是组织与细胞内化学成分的组成，组织化学技术的基础是已知的化学反应。组织化学与生物化学也有区别：虽然二者都着眼于组织与细胞内的化学组成成分及其含量，但生物化学研究常将组织破坏、制成匀浆、然后进行化学成分的测定，其化学反应主要在试管内进行故其定位性能差；而组织化学技术则要求尽可能在原位显示化学成分，故其定位、定位性能好。组织化学的发展借助了许多物理学技术，特别是显微镜技术、电镜组织化学、电镜细胞化学、荧光组织化学以及定量组织化学等，都是基于物理学技术发展起来的组织化学分支。一、组织化学的特征组织化学是应用物理的和化学的方法来查明细胞组织的化学成分；是用组织学、化学、物理学原理研究细胞组织的结构、功能与化学的关系；是对细胞组织成分的勘察、定位、定性、定量的特征来认识细胞组织结构与功能的关系。因此，它具有较强的特征性。1.组织化学的要求组织化学是建立在组织细胞形态学、生物物理学、生物化学及分子生物学学科基础上的一门边缘学科，因此组织化学研究具有如下要求：（1）要求形态结构真实完整。（2）要求显色全过程均属于化学反应。（3）要求化学反应在组织细胞的原位被显示（4）要求弄清化学成分与形态结构及空间的关系。2．研究方法组织化学的研究方法随着现代物理、化学技术的发展而不断更新，不断增多。总体说来，可分为两大类：一类是分离分析法，另一类是原位分析法。（1）分离分析法分离分析法是将组织细胞的微小器官从器官、组织、细胞内原位分离出来，测定其化学成分和分析化学组成与组织细胞的关系。其中包括匀浆超速离心及分层分析法和显微解剖分析，即组织切片的微量化学分析法。（2）原位分析法组织细胞在器官原位上不经分离，用化学试剂与组织细胞内的某些物质进行化学反应，最终在局部呈现有色反应，通过显微镜及其他仪器，如分光光度计、荧光显微镜等组织细胞内的化学反应进行定位、定性和定量研究。常用的方法包括：①组织细胞吸收光谱分析法。②荧光分析法。③放射自显影术。二、组织化学实验的基本条件组织中的各种物质可籍特殊的化学反应被勘定。组织化学需要各种化学试剂，许多著名的组织化学研究室均有合成化学试剂的实验室，以保证创建或改进组织化学的技术方法。良好的组织化学方法必须具备下列条件：1、反应要具有专一性。2、高度稳定性、重复性。3、必须保持组织结构的完整性。4、能够作对照实验。5、反应产物必须呈现颜色。6、反应结果必须是不溶性的有色沉积。7、必须已知化学反应的全过程及影响反应的理化因素。8、必须了解制片的过程对组化反应的影响。三、组织化学的基本原理研究组织细胞的化学及其化学反应机制是为了了解机体器官、组织、细胞生理和病理功能的一种必要方法。组织化学是用物理学和化学技术研究组织与细胞内的化学成分，并观察这些化学成分的定性、定位、定量与变化规律的科学。它的理论基础是在已知的化学反应基础上，严格控制其化学反应过程的科学。诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类、无机盐及酶类等（具体的反应原理见第4、5、6章）。