组织化学技术教程2

第三章组织化学的基本技术组织化学发展到今天，它的技术多而复杂，但基本技术是容易掌握的。从样品的取材、固定剂的选择、切片的制备、孵育反应、各种溶液的配制以及光镜组织化学技术和电镜组织化学技术等，每项技术都有明确的要求和规范的操作程序。进行没项工作，应事先做好准备，按技术程序进行，可做一定的预备实验，效果稳定后，再开始实验研究，这样才能达到预期的科研效果。一、样品的取材样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。如取材的器材；动物标本准备，一般轻微麻醉，迅速取材为好。现将取材的原则和具体要求分述如下：⑴刀剪锐利、洁净。⑵快速、准确、尽量保持生活状态，力争1分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分钟。要清楚取材的部位和内部，对病理组织还应做到以下几点：①材部位必须是主要病变区。②必须取病灶与正常组织的交界区③必要时取远离病灶的正常组织做对照。⑶一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。⑷低温操作，防止自溶现象，通常以0℃-4℃的低温条件下操作为佳。⑸定位准确，取材时必须注意样品的定向和定位，即头、尾、左、右以及上、下方向。切好的样品贴放在滤纸片上，标记好定向标志，防入预冷固定液内，或冰冻切片或短时间冷冻保存。⑹样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内，免疫组织化学样品大约在:2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。电镜样品规格要求切成0.5-1.0cm3小块。二、固定1．固定的目的要求固定是将组织尽可能保持原有生活状态以适用于某些研究程序的一种方法。固定有如下几方面的目的。⑴不仅保持组织生前的形态结构，还要保持结构的化学成分和活性。⑵促使组织凝固、硬化，保持一定的形状、体积。⑶增加媒染作用，便于染色；增加折光率，便于观察。⑷杀死活细胞或活组织，以进行组织化学反应。由于固定的上述目的要求，许多良好的组织学固定液，却不能用于组织化学标本，特别是酶组织化学标本和免疫组织化学标本。2．固定剂的选择用于组织化学的固定剂有很多种，一般可分为单纯固定剂和混合固定剂两大类。所有的组织化学标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。常用组织化学固定剂举例如下：⑴醛类固定剂：甲醛、戊二醛；中性福尔马林，多聚甲醛等。⑵非醛类：丙酮、酒精、Zenker’s液和Carnoy氏液等等。应用固定剂时应查阅有关的文献资料，对前人未做的方法应慎用。固定剂穿透组织的速率有很大特异性，不同的固定液其穿透组织速率可有明显的不同（穿透因子不同）：t=k·de[t=时间；d=组织深度；k、e为穿透因子（常数）]3．固定的方法⑴原位固定法原位固定法是在保持动物对其器官组织血液供应的条件下，边解剖边向所取样本的部位滴加预冷的固定液的一种方法。这种方法有益于组织细胞酶活性和结构的保存，不足之处是对动物刺激时间较长，因此应快速取样，断头处死动物。⑵浸透固定法浸透固定法是将组织块浸泡在固定液内而固定的一种方法。在组织化学样品的处理上，对浸透的时间、温度有一定的要求，特别是免疫组织化学样品的要求更严一些。⑶灌流故定法灌流故定法是通过血管的途径，将固定液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方法。这种方法的特点是：快速、固定充分，但是对固定液的温度、压力及取材时间有严格的要求。⑷培养细胞和外周血细胞固定法培养细胞核外周血细胞的固定方法比较特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10—30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛固定或采取双重固定法。外周血通常采用涂片，以甲醛缓冲固定液固定。电镜酶组化则须离心沉淀后，用戊二醛固定（具体法见第4，5，6章）。4．固定后的处理——漂洗已固定的组织样品，在切片之前必须进行漂洗，其主要目的是洗去组织中存余的固定液。这样做有助于酶活性的提高，可避免样品下一步和其它液相的液体接触，引起组织的结构改变和酶活性的降低，漂洗要求最适的PH值、渗透压、温度和时间来进行,否则会影响试验的结果。三组织切片技术一般的组织化学染色切片厚度要求在5～7µm左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在20～100µm之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有：冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。1．冰冻切片冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。它的突出特点：能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性。⑴骤冷（Quenching）1）骤冷的目的①最主要的目的是防止标本内的水结成冰晶——破坏标本结构。②杀死组织（细胞）。③快捷制片。2）骤冷的方法一般可以用四种方法骤冷，应根据实验室条件选择。①Chayen氏骤冷法（目前常用的骤冷法之一）②液氮法(也是常用的骤冷方法之一)③冻干燥法（抽干组织中的水分）④冷冻替代法（置换组织中的水分）⑵切片骤冷后的组织块切片机上切片，目前的切片机有两类：1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、甲醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片机）。开放式冰冻切片机由于暴露于空气中，温度不易控制，技术难度大，现多已淘汰。2）恒温冰冻切片机（Cryastat）——常用恒温冰冻切片机切片后如不染色，必须冷风吹干，贮存于低温冰箱内或短暂预固定后，冰箱贮存。2．石蜡切片常规石蜡切片、HE染色程序：⑴取材⑵固定⑶脱水：升梯度酒精脱水50%→70%→80%→90%→95%→100%3～4h1.5h⑷透明：用二甲苯、观察组织块至透明为止（0.5～1h，共两次）⑸浸蜡：一般用两个蜡缸。石蜡Ⅰ（＜60℃＝1h；石蜡Ⅱ（60℃）2h。⑹包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快速冷却。⑺切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展片、捞片和贴片。⑻染色——HE染色步骤：1）二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。2）降浓度梯度酒精脱水（100%→95%→90%→80%→70%）。每级脱水2～3分钟以除二甲苯。3）蒸馏水洗，去乙醇10～30分钟。4）苏木精，染细胞核，2～3分钟。5）0.5%盐酸酒精分化数秒。6）流水冲洗，30～40分钟。7）入伊红2～3分钟，细胞染成粉红色。8）水洗，去浮色，数秒。9）升梯度酒精脱水（70%→80%→90%→95%→100%），每级3～5分钟。10）二甲苯10分钟，使标本透明。11）封固。※酶组化和免疫组化与常规石蜡切片略有不同：①脱水透明应在4℃下进行，以尽量减少酶和抗原的损失。②组织块：2cm×1.5cm×0.3cm。以充分脱水、透明、浸蜡③浸蜡、包埋：＜60℃，软蜡为佳。四、孵育反应1．配制孵育液的要求⑴清洗器具，过酸冲洗。⑵现用现配，保持新鲜。⑶严格配比，保持平衡。⑷防止污染，过滤为佳。⑸优选试剂，注意纯度。2．孵育的温度和时间温度对酶细胞化学反应影响很大，一般孵育的温度有37℃（温箱）；15～20℃（室温；0～4℃可延长时间，一般为几个小时乃至过夜。最佳条件要根据所用样品的种类以及固定的不同条件而定，因此应借鉴前人的经验安排预实验。3．孵育的方法常用的孵育方法有两种，即贴片孵育法和漂浮孵育法。⑴贴片孵育法贴片孵育法是将切片贴在盖片或载物片上进行孵育。若是冰冻切片，须在空气或冷冻干燥后，经缓冲液漂洗，然后入孵育液内。⑵漂浮孵育法将切片漂浮于孵育液中进行培育，此法技术难度较大