细胞培养基和发酵液中氨基酸的检测

细胞培养基和发酵液中氨基酸的检测摘要：本文建立了一种采用离子色谱法，积分脉冲安培检测器测定细胞培养基和发酵液中的氨基酸的方法。选择的色谱条件为：采用AminoPacPA10分析柱和AminoPacPA10保护柱，水、醋酸钠和氢氧化钠缓冲溶液梯度淋洗，积分脉冲安培检测。该方法检测限（S/N=3）为0.8-4.0μg/g，氨基酸在100mM（1.0nmol）以内都有线性，RSD0.15–0.69%，可用于具体样品的检测。关键词：离子色谱；氨基酸；AminoPacPA10大多数氨基酸具有弱发光基团，需在高浓度时才可用紫外吸收检测。发酵液或细胞培养基中的许多成分也具有发色团，用吸收法检测时它们的吸收会干扰氨基酸的直接检测。氨基酸、糖类、乙二醇、乙醇、胺、含硫化合物都能够发生氧化反应，因此，可以用安培法直接检测这类物质。安培检测法对在特定电压下发生氧化反应的分析物具有专一性，同时在此电压下，其它所有化合物都不能被检测。积分脉冲安培法检测（IPAD）是一种强大的检测技术，它有很宽的线性范围和很低的检测限。AAA-Direct.将阴离子交换（AE）和IPAD两种方法结合起来。AminoPacPA10是一种高效阴离子交换柱，用它可以分离所有常见氨基酸。对同时含有糖和氨基酸的成分复杂的样品，如细胞培养基和发酵液，利用AAA-Direct可以同时检测其中的糖、乙二醇、糖醇（醛醇）和氨基酸，而基本不受其他成分的干扰。虽然基于柱前和柱后衍生的氨基酸分析方法在评价样品中氨基酸的含量方面有广泛应用，但是这些方法运行费用高，且不能同时分析糖和氨基酸。AAA-Direct仅使用一种色谱方法，样品直接进样，就可实现细胞培养基和发酵液中所有常见氨基酸的同时检测。酵母和细菌发酵液样品中同时存在糖、糖醇、乙醇、乙二醇成分的情况下，应用AAA-Direct分析其中的常见氨基酸。酵母提取物－蛋白胨－葡萄糖培养液（YPD）和LB培养液是培养真核和原核细胞的常用培养基，无血清无蛋白杂交瘤细胞培养基、MEM和胎牛血清常用于培养哺乳动物细胞或作为培养基的添加成分。这些培养基成分复杂，并且都含有未知成分。因此，分析这种样品对大多数色谱方法都是一个巨大的挑战。YPD和LB培养基中存在无机和有机阴离子成分以及糖类和醛醇；无机和有机阴离子成分可以用IonPacAS11阴离子交换柱和抑制电导检测分析，糖类和醛醇也可以用CarboPacPA1和MA1柱分析。在这篇应用注解中，使用AminoPacPA10阴离子交换柱来分离细胞培养基和发酵液中的氨基酸和糖类。典型的细胞培养基和发酵液样品中都含有较高浓度的蔗糖（100mM）或其它糖类作为碳源。高浓度糖类的存在可能会与氨基酸发生共洗脱从而影响氨基酸的检测。糖和常见氨基酸是否可以同时检测取决于样品中糖的种类。这篇应用注解提供了一种新的方法，能在常见糖类存在的情况下对氨基酸进行检测。1实验部分1.1仪器与试剂DionexBioLC系统组成：GP50梯度泵，2mm微孔（选择在线脱气）；ED50电化学检测器，pH／Ag／AgCl参比电极，AAA-Direct可抛弃金工作电极，AAA-Direct普通金工作电极；AS50自动进样器；AS50TC柱温箱；Chromeleon色谱工作站。NaOH，50%(w/w)（FisherScientificandJ.T.Baker）；电阻率为18MΩcm的去离子水；无水NaAc(AAA-DirectCertified,DionexCorp.,P/N059326);N-乙酰-D-葡萄糖胺、无水D-树胶醛糖、无水D-纤维二糖、龙胆二糖、n-辛基-.-D-吡喃葡萄糖、葡萄糖醛酸、α－水合乳糖、乳果糖、来苏糖、麦芽六糖、麦芽四糖、甘露糖胺、甘露糖、蜜二糖、亚硫酸钠、β-D-S-葡萄糖、松二糖、尿素、无水D-木糖、Palatinose、山梨糖、肌醇、均购自SigmaChemicalCo.；甘露醇，ACS级(J.T.BakerIncorporated)；山梨醇(EastmanChemicalCo.)；Sucralose(McNeilNutritionals,Inc.)；蔗糖(FisherScientific)；丙三醇(EMScience)；甲醇(FisherScientific)。麦芽糖醇、水合麦芽三糖、L-阿拉伯糖均购自AldrichChemicalCo.；D-2-脱氧葡萄糖，参考级、赤藻糖醇、D-果糖，参考级、海藻糖，参考级、半乳糖醇，参考级、半乳糖胺，参考级、D-半乳糖，参考级、D-葡萄糖胺，参考级、.-D-葡萄糖，参考级、水合麦芽糖，参考级、五水合棉籽糖，参考级、L-水合鼠李糖、核糖醇，参考级、D-核糖，参考级、α-α-二水合海藻糖，参考级均购自PfanstiehlLaboratories。氨基酸混合标准样品(NIST,StandardReferenceMaterial2389)；丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、牛磺酸、丝氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、正亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、甘氨酸、组氨酸、羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、尿刊酸均购自SigmaChemicalCo.。1.2色谱条件AminoPacPA10法：分离柱：AminoPacPA10分析柱和AminoPacPA10保护柱流速：0.25mL/min淋洗液：A：水；B：250mMNaOH；C：1MNaAc进样体积：10或25μL柱温：30°C检测(ED50)：积分脉冲安培检测,可抛弃性或常规金工作电极;参比电极在pH模式下梯度条件见下表1。ED50检测波形：图1利用AAA-Direct方法的标准梯度条件检测到的发酵液中常见氨基酸(A和C)和糖类(B)。葡萄糖与缬氨酸和苏氨酸共洗脱。2结论:上述实验结果表明，AAA-Direct可以用来分析酵母和细菌细胞培养基（发酵液）和哺乳动物细胞培养基中的氨基酸。当样品基质中含有过量糖类时，调整初始淋洗液强度和等度淋洗的时间，几乎所有氨基酸的分离选择性都会得到改善。每种氨基酸和糖的电化学反应的线性范围都各不相同，取决于所用的AAA-Direct条件。