神经末梢突触囊泡释放神经递质过程的调控蛋白

·综述·神经末梢突触囊泡释放神经递质过程的调控蛋白3蔡倩1陆佩华1△盛祖杭1,2△(1上海第二医科大学神经生物学实验室,上海200025;2美国国家健康研究院突触功能研究室)摘要神经末梢突触囊泡释放神经递质是一个复杂且受到精细调控的过程,涉及多种蛋白质间的相互作用。位于突触囊泡膜上的突触囊泡蛋白/突触囊泡相关膜蛋白(synaptobrevin/VAMP),与位于突触前膜上的syntaxin和突触小体相关蛋白SNAP225,三者聚合形成的可溶性N2甲基马来酰胺敏感因子(NSF)附着蛋白受体(SNARE)核心复合物是突触囊泡胞吐过程中的核心成分。本文主要围绕参与突触囊泡胞吐过程,以及调节SNARE核心复合物的形成,解离及其功能的蛋白质,并对突触囊泡胞吐过程的分子模型作一概述。关键词神经递质;胞吐;突触囊泡;SNARE蛋白;调控蛋白学科分类号Q189ProteinsRegulatingNeurotransmitterReleaseofSynapticVesiclesatNerveTerminalsCAIQian1,LUPei2Hua1△,SHENGZu2Hang1,2△(1DepartmentofNeurobiology,ShanghaiSecondMedicalU2niversity,Shanghai200025;2SynapticFunctionUnit,NationalInstituteofNeurologicalDisordersandStroke,Bethesda,Maryland20892,USA)AbstractNeurotransmitterreleaseofsynapticvesicleatnerveterminalsisacomplicatedandelabo2ratelyregulatedprocess,involvingacascadeofprotein2proteininteractions.TheSNAREcorecomplexconsistingofsynaptobrevin/VAMP(asynaptic2terminalprotein),syntaxinandSNAP225(synapticmembrane2associatedproteins),actsasthemembranefusionmachineryandplaysessentialrolesinsynapticvesicleexocytosis.Thisreviewwilldiscussproteinswithpotentialrolesinsynapticvesicleex2ocytosisbyregulatingassembly,disassemblyandthefunctionofSNAREcomplex,andsumupthemolecularmodelofvesicleexocytosis.KeywordsNeurotransmitter;Exocytosis;Synapticvesicle;SNARE;Regulatingprotein神经递质释放过程是神经系统信息传递的基本过程,是生命活动的基本事件之一。因此,对神经递质释放的分子机制的研究已成为神经科学领域的一个热点,而突触囊泡胞吐过程又是神经递质释放机制中的一个核心问题。自20世纪90年代在酵母上发现了囊泡循环所必需的突触同源蛋白以来,各种膜转运的基本机制和分子模型不断提出。由于突触囊泡释放神经递质是一个由多种蛋白质介导的复杂过程,并在多个环节受到精确调控,因此,越来越多的研究集中于参与该过程的蛋白质及其相互间的作用。本文结合最新研究进展,对参与该过程的调控蛋白作如下综述。一、NSF和可溶性NSF附着蛋白膜受体(SNARE)复合物目前认为,SNARE核心复合物是突触囊泡胞吐过程中的核心成分,而且参与几乎所有分泌细胞的胞吐过程。它由三种蛋白质组成:位于突触前膜的t2SNARE(target2SNARE),包括syntaxin和突触小体相关蛋白(synaptosome2associatedproteinof25kD,SNAP225);位于突触囊泡膜上的v2SNARE(vesicle2SNARE),为突触囊泡蛋白/突触囊泡相关膜蛋白vesicle2associatedmembraneprotein,VAMP/synaptobrevin)。SNARE的命名源于它们最初是作为N2甲基马来酰胺敏感因子(N2ethyl2maleimide2sensitivefactor,NSF)和可溶性NSF附着蛋白(sol2ubleNSFattachmentproteins,SNAP)的膜受体,即SNAPs蛋白受体(SNAPreceptors,SNARE)。3国家海外、香港青年学者合作研究基金课题(39928001)△通讯作者Syntaxin和VAMP均通过羧基末端的跨膜区分别锚定于突触前膜和突触囊泡膜上,而SNAP225无跨膜区,它通过其中间区4个半胱氨酸残基中的脂酰基锚定于突触前膜。目前已在哺乳动物细胞中发现30多种SNARE超家族成员,多数成员在分泌过程中都有其特异的亚细胞定位。生化研究结果显示,重组syntaxin¶SNAP225和VAMP三者结构中的α螺旋形成区(coiled2coildomain)可形成一个稳定的核心复合物(corecomplex),该核心复合物可抵抗SDS的变性作用,蛋白酶的水解以及梭状芽孢杆菌神经毒素的裂解作用,其热稳定性可达到约90℃。SNARE三聚体核心复合物的亲和力很高,但核心复合物相互作用的解离常数尚未确定。二、突触囊泡胞吐过程的分子模型[1]在SNARE形成核心复合物之前,Munc18/nSec1与syntaxin结合,使其空间构型处于闭合状态(closedconformation)。一旦胞吐过程启动,Rab蛋白促进Munc18/nSec1与syntaxin的解离,使syntaxin闭合的空间构型打开,启动SNARE核心复合物形成。核心复合物中由syntaxin和VAMP/synaptobrevin各提供一个α螺旋,SNAP225提供两个α螺旋,形成核杆状四螺旋束。核心复合物使突触囊泡膜与突触前膜相互靠近,此时突触囊泡处于预融合(prefusion)状态。Ca2+的大量内流可诱导SNARE核心复合物中的螺旋束完全聚合(zipping),促使突触囊泡膜与突触前膜融合,囊泡中的内容物释放。之后,稳定的SNARE核心复合物位于同一侧质膜面上(cis2SNARE)。此时,胞质中的α2SNAP和NSF募集至此,与SNARE核心复合物结合,NSF发挥ATP水解酶的作用,使SNARE核心复合物解聚,结果SNAP225、VAMP和syntaxin又呈游离状态,经再循环到达合适位置并加入下一个突触囊泡胞吐过程(图1)。图1突触囊泡胞吐过程的分子模型摘自Chen和Scheller,NatureReviewsMolecularCellBiology,2001,2t98～106尽管已有许多实验证实SNARE复合物介导神经递质释放的膜融合过程,但在酵母液泡(vacuolar)融合系统中发现,裂解并以抗体阻断SNARE复合物再聚合后并未影响液泡内容物的混合。在海胆卵融合系统中,Ca2+可使SNARE复合物解聚,而皮质囊泡的同型融合过程并未受影响。研究结果还发现,在VAMP2(synaptobrevin)缺陷或经神经毒素裂解的酵母、苍蝇和蚯蚓中,膜融合过程并未消失[2]。Peters等发现,在适合的离子浓度和相应蛋白质存在的条件下,脂质膜无需SNARE复合物的参与也可融合[3]。那么,SNARE复合物在突触囊泡分泌过程究竟发挥什么作用?尽管SNARE直接参与膜融合过程的观点已广为接受,但目前尚不能排除另一种可能性,即SNARE复合物并非膜融合过程所必需,而是仅参与一个催化过程,该过程可以稳定膜融合中间体或融合孔(fusionpore)的过渡状态[2]。进一步阐明融合孔性质的研究无疑将有助于揭示参与该过程蛋白质间的复杂作用。三、GTP结合蛋白及其相关蛋白位于突触末端的GTP结合蛋白,如rab等,含有GTP酶的基序以及GTP/GDP结合区域。在突触囊泡胞吐过程中,GTP结合蛋白通过结合GTP且发挥GTP酶的作用,水解GTP,与SNARE复合物发生短暂的相互作用,调节SNARE核心复合物的形成,可抑制突触囊泡胞吐,并调节神经递质释放。(一)RabRab是一类重要的小分子量GTP结合蛋白,与突触囊泡膜结合。目前研究认为,Rab家族可能在突触囊泡运输过程的定向(targeting)和捆绑(tethering)阶段发挥重要作用,由此决定囊泡转运过程的特异性。研究发现,rab3的同源蛋白Ypt1p序列可调节酵母中SNARE复合物的形成。Rab3A是Rab家族中的主要蛋白。在神经末梢,rab3A及其潜在的效应蛋白rabphilin3A和rim通过水解GTP参与神经递质的释放过程。Rab3A同时对海马CA3区苔状纤维突触长时程增强(LTP)的形成至关重要[4]。(二)RimRim是rab3的效应蛋白,特异地定位于突触的活性区(activezone)。Sandhya等的研究结果显示,rim蛋白不参与突触囊泡的搭靠(dock2ing)过程,但可能调节其与突触前膜融合的启动(priming)过程[5]。目前认为,突触囊泡搭靠至活性区后激活rim蛋白,后者再激活Munc213,Munc213可促进Munc218/nSec21从syntaxin上解离,并打开syntaxin闭合的空间构象,进而诱发SNARE复合物形成,使突触囊泡进入预融合状态[6]。(三)Rabphilin3ARabphilin3A也是rab3的效应蛋白,位于突触囊泡膜上,以GTP依赖性方式与rab3A结合。将重组的rabphilin3A蛋白注入枪乌贼巨大突触可抑制突触囊泡胞吐;而对rabphilin基因敲除小鼠的研究发现,在神经递质释放过程中,rab3A发挥调节作用时可无需rabphilin参与[7]。其功能有待进一步阐明。四、与SNARE作用的蛋白(一)Munc18/nSec1Munc18/nSec1作为伴侣分子(chaperone)与闭合构型的syntaxin结合,调节SNARE核心复合物的形成。体外结合实验显示Munc218可与syntaxin相互作用,并抑制syntax2in与SNAP225或synaptobrevin结合,最终抑制SNARE复合物的形成。在枪乌贼巨大突触上的功能研究显示,Munc218可抑制神经递质释放。但过度表达Munc218的PC12细胞,其分泌功能并未受到影响。Voets等的最新研究结果显示,缺乏Munc1821的小鼠嗜铬细胞,其Ca2+依赖性大囊泡(LDCV)的分泌功能以及搭靠活性区的大囊泡数量下降至对照组的10%,但其它与释放相关的动力学特征与对照无差异。在牛嗜铬细胞中过度表达Munc1821则可提高可释放囊泡的数量,且囊泡的供应也加快,故推测Munc1821不仅在SNARE复合物形成过程的上游发挥作用,还可加速大囊泡的搭靠活性区[8]。该结果提示,对于不同类型的神经内分泌细胞,Munc218/nSec1在神经递质释放过程中的调节作用存在明显差异。(二)α2SNAP和NSF二者最初是在高尔基体转运实验中被发现,NSF具有ATP酶活性,与α2SNAP在突触膜融合后解离SNARE复合物,是调控神经递质释放的另一个分子伴侣系统。Littleton等用果蝇(Drosophila)的syntaxin和NSF突变体研究发现,膜融合后,NSF可解离位于突触前膜的SNARE复合物(cis2SNARE)。NSF不参与膜融合事件,作用于突触囊泡分泌和内吞过程的中间阶段,分解SNARE复合物,促进它的再循环[9]。α2SNAP和NSF的作用是使SNARE复合物始终处于解离和聚合的动态平衡中。(三)SnapinSnapin是本文作者实验室最近克隆的一个调控蛋白,位于突触囊泡膜上。通过与SNAP225的直接作用而与SN