神经生长因子的研究进展

神经生长因子的研究进展赵永芳秦妮张愚（武汉大学生命科学院430072）神经生长因子（NerveGrowthFactor,NGF)是一种由118个氨基组成的蛋白质，已成为神经科学领域中最引人注目的课题之一。NGF是维持交感神经元和感觉神经元生长、发育和功能所必需的营养因子。NGF的营养作用与一些神经元退行性疾病，如人们关注的Alzheimer's疾病的发生与发展有关密切作用；在某些神经系统损伤时，多次给予明显降低；在一些肿瘤中NGF及其受体常有高浓度表达。这些现象都促使人们将目光越来越多地集中到NGF上，并对其临床应用寄予很大的期望。现将近年来有关这方面的研究和进展介绍如下。1神经生长因子（NGF）的发现及理化性质NGF的最早发现在S-180细胞中。Buerker试验了给发育中的神经系统施加额外的同源性的组织（例如小鼠肿瘤组织），将小鼠肉瘤S-180接种在3天鸡胚的体腔内，发现感觉和交感神经链加大了20%，瘤内有了密集的神经支配。Levi-Montalcini用两组实验检测，S-180的神经营养作用是由于瘤细胞产生了一种可扩散和物质，它有刺激神经元生长以及神经纤维延长的功能。后来人们发现小鼠会颌下腺含的NGF比S-180细胞的效力大一万倍。通达对小鼠颌下腺NGF的研究，获得了许多关于NGF理化性质的数据。小鼠颌下腺中NGF以TsNGF复合物的β-NGF亚基存在。7sNGF复合物由α、β、γ3个亚基和锌离子构成，化学计算式为α2βγ2，分子量为14万，在酸（pH5）、碱（pH8）或单纯衡释时会被解离。α亚单位是非匀质的酸性糖蛋白，分子量为26KD，pH为4.3。一般认为它起保护性或携带载体作用，因为它能阻止γ亚单位对β亚单位的分解；而γ亚单位是一种精基酸特异性酯肽酶，参予NGF前体的加工，pI为5.5；锌离子则有稳定亚单位结构的作用；具备生物学功能的β亚单位是一个26.5KD的聚体由3个二硫键共价结合起来的二聚体，等电点是9.3。从小鼠颌下腺分离纯化NGF的方法已建立子多种，其中一种是利用7sNGF复合物和βNGF亚基的不同等电点，通过两次离子交换柱层析得到NGF。这种方法所分离出来的NGF二聚体缺少17-20%C末端Arg残基和35%N末端8肽序列，这是由于当暴露在颌下腺抽提物中的两种特异性酶切造成。其中缺少1个或2个C末端Arg的β-NGF的生物学活性。但却阻碍了β-NGF与α、γNGF的重新合成7sNGF复合物。但也有人认为，完整分子与缺失Arg的分子相比，在生物学效应上有不同，并会导致生理上的相关变化。这些争论还有待有一步探讨。2NGF的生物学作用NGF对生命某阶段的一些神经元群的生存和发展是必需的。交感神经元始终都对NGF起反应，但在胚胎和初生期的敏感性最高。孵化鸡胚在14天之前，感觉神经节有敏感性，此后敏感性就降低。NGF在机体组织器官（包括脑）中分布广泛。它在靶组织中的浓度与交感神经在靶区分布的密度和mR-NA含量有关系。从头所周知，无论是体外或体内，NGF对神经元的存活和生长是必须的，以抗NGF血清处理神经节细胞的组织进行培养，或去除培养基中的NGF，都能使细胞迅速死亡。Cohen和Levi-Montalcini发现，注入抗NGF的血清，可使初生小鼠产生的天然NGF的活性丧失。这些动物的行为虽然正常，但却没有交感神经节链。即所谓“交感神经免疫功能切除术”（Immunosympathectomy）。如果给母鼠注入NGF抗体，将会使胎氧缺少感觉神经系统。相反，将NGF注入胚胎小鼠或初生小鼠体内，会使感觉和交感神经节比正常的增大数倍，单个的神经元变大，内质网、神经微丝和神经微管等细胞器也增多。将NGF注入新生大鼠脑隔区、海马和新皮质时，这些部位胆碱能神经元的cAMP活性明显升高，ChAc活性增高2倍，表明NGF对脑细胞正常发育和其功能和维持有明显效应。但是老龄的感觉神经元和交感神经元对NGF反应迟钝，这种情况与老龄细胞NGF受体的减少有关。给Alzheimer's病大鼠模型脑内注入NGF的，不仅防止90%-100%胆碱能神经元的死亡，而且可预防学习和记忆能力等丧失缺陷。此外，Carraneo和Mekay实验证明，神经元前体细胞在有NGF的环境中能继续增殖。所以NGF具有调节神经元前体细胞增殖和分化的作用。NGF还能调节成熟感觉神经元中P物质的CGRP的基因表达。从分子水平来看，NGF使用使神经元的增大可伴随着生化反应的加强，摄入氨基酸等物质的量增多，对它起反应的神经元的合成和分解加强，利用葡萄糖和能力也加强，在给予NGF12小时后，酷氨酸β-羟化酶和胆碱乙酰转移酶的浓度都明显上升。用亚胺环已酮等RNA抑制物，可能阻断蛋白质神经递质酶的合成。因此，看来NGF能更多地影响蛋白和脂类的合成，也能影响神经元的合成。从虹膜培养的实验表明，NGF释放可能有其固定的释放途径，是不受钙流影响的。从结扎神经和125I标记NGF的实验清楚地显示，轴突末稍可摄取NGF，并朝胞体作逆行转动。这正是NGF生物活性的体现，即诱使轴突朝特定靶器官的方向生长。而在下述实验中更证明NGF对轴突生长方向具有决定性的诱导的作用。连续7-10天给新生大鼠注入NGF，交感神经细胞的神经纤维将通过背根节进入脊髓，并向注入NGF的脑干方向生长。若切断海马，即除去海马的胆碱能传入纤维，此时在NGF的诱导下，外周交感神经纤维将朝海马生长。3NGF的分布许多观察都支持“靶组织合成NGF”这一论点，认为靶组织合成NGF来调控交感和感觉神经元的维持和异化。首先。用机械或化学方法切除新生儿的交感神经元同样会导致神经元死亡；其次，NGF的处理能够阻止政党发生的或实验介导师的细胞死亡，此外作用在交感或感觉神经末端的NGF会结合到特异性受体，进入胞内再逆行运输到细胞体，导致一系列的变化，包括转移酶的诱导。最后，体外实验显示，仅在轴突和末稍可角及的环境中NGF的处理才有作用，而有神经元的表面其它区域则无作用。尽管在一些外分泌组织，尤其是雄性小鼠颌下腺含有大量的NGF，但这些来源很显然与神经系统的功能没有关联。而在以前，交感神经支配的交感效应器官中并未发现有NGF的合成。但现在通过一种精确至10pg的NGFmRNA检测方法，正好帮助解放此疑问。现已知，在交感效应器官中可广泛检测到NGFmRNA，通过对交感效应器官中NGFmRNA和NGF浓度比较，我们可知NGF蛋白的低浓度是由于NGF被不断地分泌，并被逆行运输至神经元细胞体，且在交感神经节中发现有大量NGF的积累。由于血清中检测不到NGF，那以靶中的NGF似乎都是就地合成。同时一个现象也值得注意，NGFmRNA的浓度与交感神经支配密度有极大的正相关，而NGF的合成水平会控制成年组织中交感支配密度。如果能探知发育中NGF基因表达水平的增高是否先天交感支配的增高，将会是个有趣的视角。在神经系统的周围可检出较大量的NGFmRNA，例如感觉神经节、交感神经和坐骨神经。而在哺乳动物大脑中有极高浓度NGFmRNA，不达在脑的不同区域NGFmRNA水平是不同的，例如海马区域就有特别高的NGFmRNA水平。从合成NGF的细胞类型来看，制造NGF的正常细胞有成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、神经鞘细胞等。而在肿瘤中和许多细胞株的细胞培养中均会发现有NGF的合成。细胞株培养液中发现有NGF的合成，而在体内这些细胞则不会合成NGF。这可能是由于组织培养中神经输入信号(neuralinput)的去除导致了NGF水平增高。4NGF合成诱导剂(NGFinducerNGFId)如前所述，NGFmRNA浓度与交感支配密度存在着正相关。于是人们想到利用一种参数来定量分析这种正相关。一种交感神经递质-去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)在组织中的浓度与NGFmRNA是成正比的。在体外，将NE加入到L-M细胞株培养中，发现NE能显著提高L-M中NGF的浓度。除了NE外，还有肾上腺素(ephnephyrine)诱导NGF。在对NE和epinerprine刺激作用的研究中，发现用0.05-0.2mMNE或epinephrine处理24,NGF浓度将增加3-20倍，其刺激作用一般会有4h的滞后。这些均表明NE和epinephrine能刺激NGF合成和分泌。同时也有数据表明，这两种试剂的作用效果与儿茶胺(catecholamines)和儿茶酚胺类似物进行实验，发现多马胺(dopamine)、麻黄宁(epinine)、异丙基肾上腺素(isoproterenol)及多巴(DOPA)均能显著地引起NGF浓度的增加。后来人们又发现许多种NGFIfd，如苯醌(bnezo、quinones)、hericenones、erinacines、fellutamides、ransuininA、ingenoltriacetate、jolkinolideB和吡咯喹啉醒(pyrroloquinolinequinones,PQQ)。其中我们将较详细地介绍PQQ的作用。为什么人们将目光聚集在NGFId上？这主要是由于NGF对前脑核基底胆碱能神经元的神经具有营养作用，于是NGF被期望用于Alzheimer's等痴呆性疾病的药物。最近有人通过NGF药理实验显示，持续地向脑内注射NGF能部分地恢复胆碱能细胞体萎缩以及提高行为操作的年老大鼠的空间记忆的持久性。同时有报道表明，NGF直接注射入Alezheimer's患者的脑内后病人已有较为明显的效果。可见，外源性NGF可在脑内作为神经营养因子来阻止神经元的死亡和提高残余神经元的活性。但是通过脑内注射外源性NGF是极为困难和不方便的，另一方面，NGF作为一大分子蛋白质，是无法在血液注射后通过脑血屏障而进入大脑发挥作用的。那么小分了量的NGFId则给人们一种启示，开始考虑利用小分子量的NGFId来作为抗痴呆药物。在诸多NGFId，PQQ是作用颇显著的一种。PQQ是新发现的一种醌酶的辅基。自从发现后，人们就陆续发现PQQ的诸多生物学和生化效应，例如对微生物的生长促进作用，对小鼠的类似维生素的作用，对自由基清除剂作用和醛糖还原酶抑制性能。通过体内、体外实验获得了一系列PQQ的数据。在L-M细胞培养中，用PQQ处理24h使NGF浓度提高了40倍，而PQQ三甲酯化合物（PQQ-TME）的效果就远不如PQQ-2Na，这意味着PQQ的羟基对于促进作用是很重要的。但是PQQ的一种衍生物噁唑（OPQ）则表现不出任何促进作用，这显示PQQ的醌基团对促进作用是必需的。（此外另一种NGFId，idebenone，含有一个benzoquinone环，也是一种自由基清除剂，于是有人也提出设想，认为NGF合成刺激作用与自由基清除之间存在一定的关联）。当用PQQ和OPQ作用于体内时，OPQ-TME有显著促进作用，而PQQ-TME则几乎空白。这就存在一种可能性，即体内的醌蛋白可能会捕获PQQ，则PQQ无法进入大脑内，且同时有实验显示当观察腹腔注射NGF后对周围神经系统的作用时，发现事先损伤的坐骨神经有很好的恢复情况，这更进一步证实PQQ的促进作用，及PQQ无法通过血脑屏障而发挥作用的可能性。OPQ-TME在体外的空白与体内的显著促进作用则可能的假设是：哺乳动物内也存在一种酶，将OPQ转化为PQQ（微生物中这种酶的存在已证实），便在脑中发挥其促进作用，促进NGF的合成，营养胆碱能神经元的生长，达到治疗Alzheimer's等痴呆性疾病的目的。因此，对PQQ及其衍生物的NGF合成促进作用开展研究将是极为有意义的。