福建农林大学蛋白质工程期末总结

蛋白质工程定义：以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术。一级结构：蛋白质分子中各个氨基酸残基的排列顺序二级结构:一段连续的肽单位借助于氢键，在一维方向排量成具有周期性结构的构想三级结构：多肽链在二级结构的基础上在进一步盘区或折叠成具有一定规律的三维空间结构四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链聚合而成特定构象的蛋白质分子叫蛋白质的四级结构超二级结构：是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成2个或多个空间上可以明显区分的三级折叠实体同源蛋白质指不同的有机体中实现同一功能的蛋白质变构效应蛋白质在表达功能的过程中构象发生变化的现象蛋白质的变性天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。复性:是指变性的蛋白质在使它变性的理化条件恢复正常后,它的结构和功能可以部分恢复的性质分子伴侣是进化上十分保守的蛋白质家族，广泛存在于多种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，帮助新翻译的蛋白的折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠。分子内伴侣将对蛋白质折叠有帮助的前导肽称为分子内伴侣。定位突变：基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等包含体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒生物信息学：生物分子信息的获取、存贮、分析和利用一次数据库：数据直接来源于实验获得的原始数据，仅对原始数据进行简单的归类整理和注释盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出透析：按照分子大小进行分离.分离取决于透析袋截留的分子量。等电点沉淀法：在一定的pH条件下，蛋白质所带的净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀蛋白质组是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质芯片也叫蛋白质微阵列是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上信号肽：引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度5-30个氨基酸）肽链蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构发生改变的过程蛋白功能芯片将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片质谱技术：生物质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异化来分离并确定分子质量穿梭载体：构建的具有两种宿主(例如，大肠杆菌和酿酒酵母)复制原点的质粒双向电泳第一向通常根据蛋白质等电点的不同进行等电聚焦电泳（IEF），然后再根据分子质量的不同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为第二向。蛋白质工程的应用：提高重组蛋白的活性、热稳定性及抗氧化能力，增强对胞内蛋白酶的抗性，延长体内半衰期，降低制品的免疫原性，改变酶促反应的Km与Vmax，改变酶的底物专一性，改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，简化纯化过程，提高产率蛋白质功能：催化/结构成分/存储/运动/转运/调节/支架/蛋白质大分子的应用：广泛应用于纺织/食品/医药/农业等领域，酶制剂的工业用途如清洁，聚氨基酸的应用去垢剂。氨基酸的理化性质：旋光性：除甘氨酸外，都具有旋光性光吸收：酪氨酸（Tyr、278nm）、色氨酸(Trp、279)和苯丙氨酸(Phe、259)能够吸收紫外光——共轭双键紫外吸收：在中性pH值下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm处。蛋白质变性的本质：二、三、四级空间结构被破坏，变性因素破坏了维持蛋白质空间结构的各种次级键以及二硫键。但一级结构完好，变性蛋白的特征：（1）生物活性的丧失——最主要标志（2）理化性质的改变：溶解度下降，易沉淀、结晶能力丧失、渗透压力、和扩散速度降低粘度、旋光性负值上升，等电点上升（3）生化性质的改变特征：分子伴侣的功能及特征帮助新翻译的蛋白的折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠。（1）同类分子伴侣在所有的生物中有惊人的相似性，表明它们在进化很保守;（2）分子伴侣在行使功能时需水解以改变构象、释放底物和进行再循环;（3）能识别暴露的未折叠的蛋白质结构域，能与多种不同的多肽相互作用，影响折叠的速率和动力学，无序列偏爱性。蛋白质分子设计的原则：1．活性设计2．对专一性的设计3．Scaffold设计(框架)4．疏水基团与亲水基团需合理分布5．最优的氨基酸侧链几何排列影响外源基因在大肠杆菌中有效表达的相关因素：⑴有效的转录起始与基因的高效表达(2)有效的翻译与基因的高效表达（3）密码子偏好性(4)外源蛋白的表达定位（5）宿主选择对表达的影响（6）培养条件的控制表达效率的影响（7）转录终止区蛋白质中功能残基的鉴定1根据结构信息确定残基的突变2利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基：高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。3突变方法鉴定突变功能残基：随机突变技术、删除分析、连接片段扫描突变定位突变的设计目标及解决方法：定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。（1）热稳定性：引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积（2）对氧化的稳定性：把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr（3）对重金属的稳定性：替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu（4）pH稳定性：替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换(5)提高酶学性质：专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度原核和真核表达系统的优缺点：目标蛋白质在大肠杆菌中的表达：大肠杆菌表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系。优点：遗传学和生理学背景清楚；易培养；外源基因常可高效表达。不足：不可进行典型的真核细胞所具有的翻译后修饰。细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏。酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。但它的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。蛋白质三维结构解析方法X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱、电镜三维重构、光谱技术、显微技术和计算机模拟X-Ray晶体衍射方法的优缺点：优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息核磁共振的优缺点：优点：可以在水溶液或有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的特点缺点：分辨率不高。目前，NMR只能用于测定小分子和中型蛋白质的结构三大核酸数据库：Genbank、EMBL、DDBJ蛋白质分离的流程：选择实验材料；实验材料预处理；蛋白质的提取；蛋白质粗分级；蛋白质细分级缓冲液的主要成分、作用、如何选择缓冲液（1）提取不同的蛋白质往往需要不同的缓冲液。2）原则：缓冲液不能与目标蛋白质相互作用；选常用的缓冲液降低成本（3）为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构和活性，含以下成分：P203缓冲对：还原剂抑制剂：加入蛋白酶抑制剂螯合剂：为了消除某些金属离子对目标蛋白质的影响，它们同时也是金属蛋白酶的强烈抑制剂稳定剂;蛋白质在高浓度条件下，蛋白质分子间相互作用，有利于降低溶剂对蛋白质的不良影响。去污剂:低浓度的去污剂有利于蛋白质的溶解，但随着去污剂浓度的提高，有可能导致蛋白质变性。防腐剂分子筛层析也称凝胶层析原理：1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落来，所以大分子物质迁移速度快；2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。填料具备的条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。离子交换层析原理：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。分类：阳离子交换与阴离子交换树脂类：分离氨基酸，孔径小；纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。当pIpH时，蛋白质带净负电荷；当pIpH时，蛋白质带净正电荷亲和层析原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体.蛋白质免疫印迹主要包括三个步骤：第一步是凝胶电泳；第二步是转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步是抗原抗体显色反应。原理：将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离,然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下,使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上,并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析。是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用研究方面得到了广泛应用并取得了许多有价值的重要发现。酵母双杂交系统由三个部分组成：BD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为靶蛋白（prey）；有一个或多个报告基因的宿主菌株。原理：不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因的表达，基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共同表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能够发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过报告基因的表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。噬菌体展示技术：原理：噬菌体展示技术就是将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的完整性和活性。蛋白质组学的难点：蛋白质组的多样性蛋白质的种类确定蛋白质组的动态性蛋白质组的时空性蛋白质组学的技术蛋白质组研究的三大基本支撑技术：双向电泳技术（2DE）计算机图像分析与大规模数据处理技术质谱技术(MS)质谱技术：生物质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异化来分离并确定分子质量。它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点，已逐步取代传统的Edman降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术，已广泛应用于二维电泳、色谱分离的蛋白质，以及蛋白质复合体的鉴定染色方法的优缺点:考马斯亮兰:灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。银染（SilverStain）:检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。荧光染色：灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色染色所需时间较短染色的动态线性范围大大