秀丽隐杆线虫

分类号编号烟台大学毕业论文利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质Screeninganti-CandidaalbicanssubstancesusingCaenorhabditiselegans利用秀丽隐杆线虫筛选抗白色念珠菌活性物质摘要：以秀丽隐杆线虫作为模型生物进行抗菌物质筛选。用白色念珠菌感染线虫后，采用不同浓度的已知抗菌药物治疗，观察线虫存活情况，确定合适用药浓度；采用微拟球藻提取物对白色念珠菌感染线虫治疗，观察线虫存活情况，与已知抗菌药物作用效果对比，从而筛选出可用于治疗白色念珠菌活性物质。实验发现，添加10~20mg/L的氟康唑对感染白色念珠菌的秀丽隐杆线虫治疗效果较好，在一定剂量范围内，治疗效果和剂量成线性关联；微拟球藻提取物不具备抗菌活性。关键词：秀丽隐杆线虫；白色念珠菌；抗菌物质Abstract:Inthestudy,Caenorhabditiseleganswereusedasmodelorganismtoscreenantibacterialagents.C.eleganswereinfectedbyCandidaalbicansandtreatedbydifferentconcentrationsofantibacterialagentswhichhadbeenknownandextractsfromNannochloropsisOZ-1,observatingthesurvivalsituationandcomparingtheeffectsofthetwoantibacterialagents,thus,thebioactivesubstancecouldbescreenedwhichcuredtheCandidaalbicans.TheresultshowedthatCandidaalbicanscouldbetreatedby10~20mg/LFluconazole,moreoverwithinthescopeofthedose,treatmenteffectandthedoseofalinearcorrelation.AndtheresultsshowedthatextractsfromNannochloropsisOZ-1didnothaveantibacterialactivity.Keywords:C.elegans；Candidaalbicans；Antibacterialsubstances目录1文献综述.................................................................51.1秀丽隐杆线虫.......................................................51.2秀丽隐杆线虫研究进展...............................................51.2.1环境毒理学的研究.............................................61.2.2程序性细胞死亡的研究.........................................61.2.3秀丽隐杆线虫感染模型的建立...................................61.2.4抗菌物质作用机制的研究.......................................61.2.5病菌致病机制和线虫免疫机制的研究.............................71.3白色念珠菌.........................................................71.4抗菌物质的筛选.....................................................81.5实验研究意义.......................................................92材料和方法..............................................................102.1材料..............................................................102.1.1实验药品....................................................102.1.2实验仪器....................................................102.1.3线虫和菌株..................................................112.1.4培养基......................................................112.1.5试剂........................................................112.2方法..............................................................112.2.1线虫培养和保存..............................................112.2.2线虫同步化..................................................122.2.3线虫真菌感染................................................122.2.4线虫抗感染治疗..............................................122.2.5观察........................................................123实验结果分析.............................................................93.1氟康唑用药浓度的选择...............................................93.2筛选可用于治疗白色念珠菌的微拟球藻提取物...........................94结论....................................................................12致谢.......................................................................13参考文献...................................................................1451文献综述1.1秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫[1]（Caenorhabditiselegans）（图1）是一种多细胞真核生物，个体很小，以细菌为食，可独立生存在温度恒定环境中，对人、动植物没有危害。成虫1mm左右，通体透明，在普通显微镜下可观察。秀丽隐杆线虫有很少的雄性个体，大多数为雌雄同体。秀丽隐杆线虫生命周期很短，从卵到成虫需要3.5d，平均寿命约为2~3周[2]。雌雄同体个体产卵孵化后，会经历四个幼虫期（L1-L4），L4期生有精子，并在成虫期产卵。雄性也能使雌雄同体受精，且雌雄同体优先选择雄性的精子。当族群拥挤或食物不足时，秀丽隐杆线虫会进入dauer幼虫期，dauer能对抗逆环境，而且不会老化。秀丽隐杆线虫基因组测序完成，是第一个完成的多细胞动物基因序列测定的动物，它的基因组序列40%以上与人类同源。秀丽隐杆线虫有5对常染色体和1对性染色体，其遗传背景清晰。图1秀丽隐杆线虫Fig.1Caenorhabditiselegans1.2秀丽隐杆线虫研究进展秀丽隐杆线虫最开始被用于研究发育生物学和神经生物学，随科学技术发展，对秀丽隐杆线虫的广泛研究，人们发现了调节器官发育及细胞程序性死亡的关键性的基因，也证明了这些基因同样存在于高等动物中。这些研究开辟了研究人体细胞的分化及演变的道路，有利于研究很多疾病的发病机制。Brenner[1]选取了秀丽隐杆线虫线虫作为生物模型，开启了一个崭新的领域。秀丽隐杆线虫具有结构简单、生命周期短、基因测序完成等优点，使其作为一种模型生物得到广泛应用。秀丽隐杆线虫作为优秀的模型生物不仅用于抗菌药物的体内研究，还被广泛应用于毒理学、基因组学、环境生物学、人类疾病模型的复制和干预。61.2.1环境毒理学的研究随着环境污染的严重，线虫开始运用于环境毒理学的研究，环境中的重金属、电辐射等毒素对人类的健康状况产生严重的威胁，线虫可以用来研究它们的作用机制，评估其危害性。线虫模型如果能模拟毒素的作用机制，那么线虫将更加广泛的用于环境毒理学的研究[3]。1.2.2程序性细胞死亡的研究秀丽隐杆线虫为程序性细胞死亡研究奠定了基础。Horvitz等[4]在秀丽隐杆线虫身上发现了基因调控的程序性细胞死亡的存在，他们发现了两个基因ced-3和ced-4，认为它们是发生细胞死亡的前提。后来，他们又发现了ced-9与ced-3和ced-4相互作用来阻止细胞死亡。对于程序性的细胞死亡的认识，使我们对一些疾病的发病机制有了新的理解，调控程序性的细胞死亡的功能性缺陷导致的疾病大体分为两种，一种是由细胞病理性丢失过多，另一种是清除有害细胞的机能受损。对疾病本身的认识的加强为疾病的治疗提供了思路，科学家现在已经开始利用程序性细胞死亡的机理来研究治疗恶性肿瘤的新办法[5]。1.2.3秀丽隐杆线虫感染模型的建立研究细菌致病机制是用线虫模型研发抗菌药物的基础。线虫是一种简单的模型生物，可以被很多病菌感染。周雨蒙等[6]建立了线虫—耐药铜绿假单胞菌感染模型，在用抗生素治疗线虫的实验中发现，可以排除毒性高、体内外相关性差的化合物，此模型为筛选得到具有良好体内效果的新型抗菌化合物或生物活性物质打下了基础。陈丽红等[7]建立了铜绿假单胞菌—线虫感染模型，确立了合适的铜绿假单胞菌培养时间和线虫的感染时间，并研究了多种抗生素对线虫的存活时间的影响，可以用于未知物质用量相当于等状态下抗生素用量的计算。1.2.4抗菌物质作用机制的研究细菌的毒力的减弱是研发抗菌物质的一个靶点，Ho等[8]通过感染秀丽隐杆线虫研究发现，雷洛昔芬可以强烈的抑制铜绿假单胞菌的毒力的产生。实验使用此药物对野生型铜绿假单胞菌进行治疗，结果发现细菌产生的绿脓菌素水平明显下降。这些结果表明雷洛昔芬可能会被用于开发新型的疗法以此来靶向治疗铜绿假单胞菌的感染。现在关于铜绿假单胞菌中的拮抗细菌群体感应系统的研究是一大热点。以抑制QS系统为靶标的分子抑制物，可用于研发新的抗菌物质。Sarabhai等[9]利用秀丽隐杆线虫模型实验发现诃子的果实中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系统，阻断了细菌细胞间的信号传递作用。它的机制是，减少了QS系统中两个重要的基因的表达，同时减弱了革兰氏阴性菌的信号分子AHL的表达，最后减弱了野生型铜绿假单胞菌的毒力并增加了它的生物膜对7妥布霉素的敏感性。1.2.5病菌致病机制和线虫免疫机制的研究不同的病菌对线虫的的致病机制并不一样，线虫自身也具有免疫机制。目前发现，可以感染线虫的病菌都是通过生理途径进行感染的。Irazoqui等[10]研究了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染线虫的致病机制。铜绿假单胞菌侵占线虫肠道，产生与毒力因子有关的囊泡，在肠道细胞累积高电子密度生物被膜样物质，使肠道细胞变异。而金黄色葡萄球菌迅速感染细胞，破坏肠道绒毛，溶解线虫细胞。金黄色葡萄球菌经过热灭后仍可以感染线虫，这是因为其可以分泌有溶血活性的热毒力因子。McEwan等[11]研究出铜绿假单胞菌会引起秀丽隐杆线虫