第02章病毒的分类与命名

第十章杆状病毒科（Baculoviridae）一、概述二、杆状病毒的基因组结构与功能（一）同源序列区（二）重叠转录物（三）早期转录物（四）晚期转录物（五）基因重组三、病毒蛋白及功能四、状病毒感染的分子机理五、重组杆状病毒表达外源基因六、杆状病毒作为杀虫剂的应用主要参考文献一、概述能够感染昆虫的病毒大约有1200种，它们主要分属于以下四个病毒科：杆状病毒科（Baculoviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）、虹彩病毒科（Iridoviridae）和痘病毒科（Poxviridae）。其中杆状病毒科病毒为数最多，大约有610种，主要感染鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）和膜翅目（Hymenoptera）昆虫。由于杆状病毒具有高度专一的宿主范围，某些昆虫被感染后可发生大规模的流行病，但对人、畜和其他动植物无害，加之病毒粒子包含在蛋白晶体内，在细胞外环境中十分稳定，故可以作为一种生物杀虫剂用于农业害虫防治，目前已有成功应用的实例；由于多角体蛋白的高水平表达，其基因区段可以用来构建重组病毒以高效表达外源基因。因此，有关杆状病毒的分子生物学，倍受广大生命科学工作者的关注。1．分类现状杆状病毒可以分为A、B、C三个亚组（Matthews1982）。A亚组：核型多角体病毒（Nuclearpolyhedrosisvirus,NPV），在单一核内蛋白晶体中包藏有许多毒粒。根据其核壳聚集的程度又可分为单一的（SNPV）和多个的（MNPV）。B亚组：颗粒体病毒（Granulosisvirus,GV），在一般情况下，在蛋白晶体中只包藏有一个毒粒。C亚组：非包含体杆状核型病毒（Non-Concludedbaculovirus），如椰二疣独角仙病毒（Oryctesrhinoceros），无包含体，可能缺少编码晶体蛋白的基因。2．形态结构杆状病毒的基本毒粒为杆状，本科病毒命名即来自于拉丁字Baculum。毒粒有囊膜，囊膜中含有丰富的类脂质，并有蛋白酶。囊膜内含有一个或多个杆状的核衣壳，核衣壳中含有病毒基因组。杆状病毒基因组为双链、环状DNA分子，低密度超螺旋。有时基因组呈多个串状，病毒DNA约40μm长，大约88~160kb，相当于大约80个非重叠基因。病毒DNA与一种碱性蛋白密切连结，这种DNA蛋白被绊缠在一个蛋白鞘内，其核心宽约32nm，长约350nm，蛋白鞘约4nm，环绕核心形成一个稀疏的壳。核衣壳含有4.5nm直径的亚单位，排列成一个开放堆积的环形结构。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcMNPV）是A亚组的代表种，研究得最为详细。它有较广的宿主范围，能感染30种鳞翅目昆虫。有关杆状病毒分子生物学的研究，大多以AcMNPV为模型。NPV和GV的病毒颗粒有两种形式，一种是病毒颗粒被包藏在蛋白晶体内形成包涵体，包涵体的基质是由一种单一蛋白组成，在NPV称为多角体（Polyhedron），在GV则称为颗粒体。多角体和颗粒体在结构上和功能上密切相关，有时这两种名称可以互用。这种多角体可以保护病毒颗粒，使其在土壤中可以存活许多年。这一小体直径约15μ，可以在显微镜下看到。包涵体非常稳定，对细菌、热和许多化学物质包括低pH有抵抗，它可溶于硫酸钠中。在pH10时，它可被毒粒携带的蛋白酶所降解，这接近于宿主中肠的pH值。因此，毒粒可被释放，能够重新开始新的感染。这种病毒颗粒称为包涵体病毒颗粒（Concludedvirusparticles,CVP）或称为多角体释放出来的病毒（Polyhedron-derivedviruses,PDV）。另一种病毒颗粒形式则不然，它在胞浆装配、芽生，进入血淋巴感染其它细胞。这种病毒颗粒称为胞外病毒颗粒（Extracellularvirusparticles,ECV）或称细胞膜芽生的病毒（Cell—releasedvirus,CRV）。在感染过程中所产生的这两类病毒，在结构、生化和抗原性上彼此不同，最明显的是在CRV有主要糖蛋白，而PDV则没有。这种糖蛋白可引起两种类型病毒在抗原性、组织嗜性和感染性方面的差异。二、杆状病毒的基因组结构与功能杆状病毒的基因组为双链、环状低密度超螺旋DNA，大小80~160kb。其中研究得比较详细的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。A、B、C组的DNA酶切图谱是不相同的。AcNPVDNA的酶切图谱如图10-1所示。SmaI酶切主要有4个片段，BamHI酶切主要有7个片段；SstI酶切主要有9个片段；XhoI酶切主要有13个片段；EcoRI酶切主要有24个片段；HindⅢ酶切主要有25个片段。因DNA是环状，习惯上以EcoRI片段的起点作为线状的0点来表示。图10-1.AcNPVDNA的酶切图（引自AdangM.,J.etal.,1982）AcNPV基因组的转录大致分为立即早期（α，感染后2小时），早期（β，感染后6小时），晚期（γ，感染后10~12小时）和晚晚期（δ，感染后15小时和以上）。除α期外，β、γ、δ期均需前一期表达的特定蛋白。迄今未发现明显的RNA剪接现象，与痘苗病毒相似，说明其基因组是连续的，无内含子。常出现重叠的RNA转录物。这些RNA具有共同的5’-端，或共同的3’-端。另一个有趣的特点是，在AcNPV基因组中，发现有5个同源序列区，称为同源序列区(Homologousregions，hrs)。这些hrs富有EcoRI切点，所以，其基因组用EcoRI消化后，在凝胶中常出现大量较小的条带，大小在72~215bp。在其它杆状病毒，如枞色卷蛾核型多角体病毒（Choristoneurafumiferananuclearpolyhedrosisvirus,CfNPV）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（Orgyiapseudotsugatanuclearpolyhedrosisvirus,OpNPV）也有类似的hrs，这说明这种同源序列区在杆状病毒中有一定的共性，但其确切的生物学意义尚不清楚。（一）同源序列区由图10-2可以看出，hr1~5并不集中在AcMNPV基因组的一个特定区段，而是分散在全基因组的不同区段上。DNA序列分析表明，hr1位于EcoRI片段（PstID）内，含4个EcoRI片段，分别为2×90bp，80bp，158bp；hr2位于HindIII-L片段内，含7个EcoRI片段，分别为87bp,89bp,90bp,108bp,115bp,138bp,161bp；hr3位于HindⅢ—B片段内，有7个EcoRI片段，分别为472bp,88bp,111bp,148bp；hr4位于BglⅡ—G片段内，其中1个EcoRI片段（120bp）位于EcoRI-Q和L内（图10-2B中hr4左侧），另3个EcoRI片段（79bp,90bp,215bp）位于EcoRI-L和E内（图10-2B中hr4右侧）；hr5位于HindⅢQ片段中，含有5个EcoRI片段，分别为77bp,90bp,104bp,106bp,107bp。在hr1~5的保守序列区彼此有88%的同源性；在同一hr区段内，EcoRI小片段之间的重复序列中也有高度的同源性，hr1，2，3的EcoRI小片段有80%的同源性，hr4的EcoRI小片段有65%，hr5的EcoRI小片段有87%的同源性。一般来说，在EcoRI切点周围区的序列最保守，远离的EcoRI切点的序列较不保守。图10-2.AcNPV基因组中hrs的位置（引自Guarinoetal.,1986）A：hrs在EcoRI酶切图上的位置，以重黑纵线1~5表示，纵线以下为克隆的区段。C为ClaI;H为HinfI;Ss为SspI;N为NsiI;X为XbaI;Sa为SalI。B：hr1~5的EcoRI切点，酶切点之间的数字表示EcoRI片段的大小(bp)。在EcoRI切点周围60bp是高度保守区，由12~155bp的非同源区序列隔开。在hr区段内，不论是保守序列，还是非保守序列，A+T均极为丰富，平均可达67%，而病毒基因组的A+T仅为58%。保守区中有28bp不完全的反向重复区（回文结构），最为保守。如图10—3所示，EcoRI切点为此回文序列的核心，在4个区段的保守的回文结构中只有一个bp不匹配。在hr5有2bp不匹配。图10-3.在hrDNA中高度保守的回文序列（引自Guarinoetal.,1986）*指不匹配的bp杆状病毒的hr序列具有增强子效应，如表10-1所示。如在质粒p39CAT的39K启动了上游不同方向插入hr区段，其下游的cat基因的表达明显增加，而且hr4的一个EcoRI小片段与整个hr区段一样，具有同样效力的增强作用。这说明AcNPVhr增强子和其它增强子有相似之处，即均有重复序列，但是后者并不是增强效应所必需的。AcNPVhr增强子在病毒基因组中所处的位置，明显地不同于脊椎动物病毒的增强子，后者位于主要的立即早期基因的几百个bp内，其功能是先顺式（Cis）激活调节基因的转录，然后再经反式作用（Trans）于晚早期基因的转录，然而AcNPV的hr增强子分散位于病毒的全基因组，距离立即早期调节基因IE-1至少有3kb远。IE-1的转录不为其所连接的hr5序列所影响，而其晚早期基因的表达却增强1000倍。鉴于SV40和多瘤病毒的增强序列也是DNA的复制起始点，所以，推测AcNPV可能也有此功能。表10-1AcNPVhr序列对CAT基因的增强效应*转录质粒CAT活性(pmol/min/Mega细胞)增强倍数39CAT1.2139CAT-hr1+117397839CAT-hr-2075172939CAT-hr2+1306108839CAT-hr2-2352196039CAT-hr3+34728939CAT-hr3-24320239CAT-hr4左-1622135139CAT-hr5+1272106039CAT-hr5-12591049*μg的上述质粒和0.1μg的pIE-1质粒转染草地贪夜蛾细胞（Spodopterafrugiperda），24小时后收集细胞测定CAT活性。实验重复3次（引自Guarinoetal.,1986）。（二）重叠转录物杆状病毒基因组转录的另一特点是带有一套重叠的RNA转录物，其数量远远多于蛋白的数量。重叠转录物不仅发生在早期转录，也发生在晚期转录。这种重叠的转录物或有共同的5’-端，或有共同的3’-端；如AcNPV物理图32.6~41.0处的重叠转录物具有共同的3’-端；HindⅢK-Q片段的重叠转录物也具有共同的3’-端；HindⅢQ-P的p10编码至少有4个转录物，即1.5kb，1.1kb，0.75kb和2.5kb均具有共同的5’-端。在AcNPV的81.2~85.0物理图单位区段（EcoRIN-J）至少有9个病毒RNA，大小为1.3~4.6kb，具有共同的3’-端，如图10-4所示。图10-4.AcNPVEcoRIN-J区段的重叠转录物（引自OelligCetal.,1987）（三）早期转录采用克隆的基因片段进行DNA—RNA杂交试验表明，在AcNPV感染秋粘虫（草地贪夜蛾）细胞系1PLB—SF214小时后，就可发现12个主要的和30个次要的转录物。在6~8小时后，病毒特异性的转录物在数量上和程度上均有明显增加（图10-5）。图10-5.AcNPV早期转录物的位置、大小和数量图中虚线至重黑线分别代表RNA-DNA杂交的程度：非常弱、弱、中等、强。数字代表转录的大小（KDAb）。N.T.表示未测定。（引自Erlandsonetal.,1985）（四）晚期转录物采用AcNPV的cDNA克隆选出的晚期转录物翻译的蛋白如图10-6所示。图中值得详细介绍的晚期蛋白有二个。一种多角体蛋白，相当于图中EcoRI片段内的32kDa蛋白，另一个是p10蛋白，相当于图中EcoRIP片段中的7.2kDa蛋白。图10-6.AcNPV晚期蛋白示意图（引自Adangetal.,1982）结果来自克隆的cDNA选出的晚期RNA翻译物1.多角体蛋