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1、第20章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)本章主要内容★HPLC的特点(与经典液相色谱和气相色谱比较)★提高HPLC柱效的方法★HPLC的仪器结构及其主要部件★几种常见的HPLC方法的原理及应用Aktaexplorer高压层析系统-紫外在线检测一、高效液相色谱(HPLC)的概念用高压输送(最高输送压力可达4.5107Pa)流动相(液体),用以特殊方法用小粒径填料(固定相)填充而成的色谱柱分离,同时柱后连有高灵敏度检测器,可对流出物进行连续检测的液相色谱HPLC是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的§20-1概述二、与经典液相色谱的比较经典LCHPLC柱内径1~5cm~0.4cm柱长度50~100cm15~50cm填充物粒度150~200m4~10m使用压力1~10atm50~200atm分离时间0.5~1天~10min1、基本特点高效、高速和高灵敏度•GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体,在分离中只起运载作用,对组分作用小;•HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合,可供选择的机会多;它除了起运载作用外。
2、,还对分离产生很大贡献(分离可通过流动相控制或改进)2、操作条件HPLC的分离速度、柱效和灵敏度均低于毛细管GC三、HPLC的特点(与开管气相色谱比较)流动相对分离起重要作用,且可以选择的流动相种类很多•GC常在高流速和高温下进行;•HPLC常在低流速和室温下进行。流动相流速与操作温度低三、HPLC的特点(与开管气相色谱比较)3、影响柱效有差别•开管GC中无涡流扩散项,柱内效应主要由分子扩散决定•HPLC中分子扩散可以忽略,柱内效应主要由涡流扩散和传质阻力决定柱内效应的影响因素与程度不同操作压力高GC采用低压(5105Pa)分离;HPLC采用高压((50350)105Pa)分离2、操作条件★GC采用程序升温提高分离速度与分离效率,实现沸点相差很大的混合组分之间的分离★HPLC采用梯度洗脱提高分离速度与分离效率,实现极性相差很大的混合组分之间的分离三、HPLC的特点(与开管气相色谱比较)4、分析对象及范围更广:GC只限于气体和低沸点热稳定化合物(占有机物总数的20%)HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物(占有机物总数的80%),3、影响柱效有差别柱外效应影响大HPLC。
3、的柱外效应比毛细管气相色谱严重提高HPLC柱效的方法★恰当提高柱温★减少填料的粒径和空穴深度★采用低粘度和低流速的流动相★减少柱外死体积§20-2高效液相色谱仪一、HPLC仪器的结构•流动相储器和溶剂处理系统•高压泵系统•进样系统•液相色谱柱•检测器FL2200高压输液泵福立版权所有2002V1.2FULI运行控制基本设置时间程序辅助功能测量波长254nm响应时间1s波长:254nmAbs:0.0001s=10000r=200000调零1波长2量程3响应时间D2基线1.溶剂瓶(淋洗液)2.高压输液泵3.手动进样器(六通阀)4.液相色谱柱5.紫外检测器6.废液排放图1柱架角板柱架圆柱体进样阀夹色谱柱夹不锈钢过滤头1、基本组成:贮液器高压泵检测器梯度淋洗装置色谱柱压力表进样器馏分收集器记录仪进样系统分离系统检测系统附属系统一、HPLC仪器的结构2、HPLC仪器的结构及工作流程高压输液系统柱温箱二、流动相储器和溶剂处理系统1、贮液器•配有孔径约为2m溶剂过滤器•配有溶剂脱气装置2、流动相输入方式•等度洗脱方式•梯度洗脱方式在分离过程中,流动相的组成与性质保持稳定在分离过程中,流动相的组成与。
4、性质按一定方式改变,以缩短分离时间,提高分离效率梯度洗脱方式类似与GC中的程序升温分离,主要用于极性差别很大的混合组分分离三、高压泵系统1、高压泵(1)对高压泵的要求有足够的输出压力且压力恒定、脉动小;输出流量恒定且范围可调;便于迅速更换溶剂;耐腐蚀(2)高压泵的种类往复式塞泵2、流速控制和程序系统恒压力泵螺旋注射泵四、进样系统直接注射进样——使用微量注射器进样特点:装置简单、死体积小;但进样量小且重现性差。高压六通阀进样装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱特点:进样量可变范围大,进样准确,重复性好。自动进样特点:进样量可变范围大,进样准确,重复性好,一次可连续进样上百个,适合于大量试样自动化分析。进样阀五、色谱柱(分离系统)——色谱仪的心脏1、色谱柱组成与种类要求——耐高压、柱接头的死体积小材料——内壁光滑的优质不锈钢或其它金属形状——柱长多为10~50cm,内径为4~5mm柱管固定相颗粒小(一般为20~75m;高效柱为3~10m)填充均匀填充方法:多彩用匀浆法溶剂要脱气,溶剂和样品应过滤,防止堵塞。加前置柱。更换流动相要渐变。用后要保护好。3、使用色谱柱注意事项2、保护柱与柱。
5、恒箱波长可的松氟美松皮质酮六、检测器1、对检测器的要求灵敏度高、死体积小、线性范围宽、重现性好,响应快、噪音低、对温度和流速的变化不敏感,应用范围广2、常用检测器溶质性质检测器仅对组分的物理或化学特性有响应特点:种类:各种光谱及一些电化学检测器;如:紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器、红外检测器、伏安检测器总体检测器对组分及洗脱液总的物理或化学性质有响应示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器(离子色谱中用)石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液特点:种类:§20-3HPLC的分类及几种简介按分离原理与固定相为按流动相与固定相极性差异为正相色谱反相色谱亲和色谱(AffinityChromatography)(液-固)吸附色谱(Adsorptionchromatography)离子色谱(Ionchromatography)凝胶色谱(Gelchromatography)(液-液)分配色谱(Partitionchromatography)一、分配色谱2、分离原理根据组分在互不相溶的两液相中溶解度的不同而具有不同分配系数进行分离。1、定义——固定相为液体的液相色谱3、固定相涂在固体载体上的固。
6、定液键合固定相稳定、不易流失、能用于梯度洗脱以硅胶为载体,利用硅羟基键合有机基团后得到的固定相分类反相键合固定相(键合了疏水性基团)正相键合固定相(键合了亲水性基团)——以极性溶剂洗脱,产生反相色谱——以非极性或弱极性溶剂洗脱,产生正相色谱特点:硅胶的化学键合反应SiOOOHSiOHSiOH+SiCH3RCH3ClSiOOOSiOHSiOHSiRCH3CH34、固定相与流动相的选择及洗脱顺序在分配色谱中,流动相的极性与固定相极性一般相反③极性固定相,选用非极性流动相,产生正相色谱;非极性固定相,选用极性流动相产生反相液液色谱①固定相极性与分析物极性粗略相配,用极性明显不同的流动相洗脱。组分极性与固定相越相近,出峰越晚②流动相极性与分析物极性匹配,用极性完全不同的固定相。组分极性与流动相越相近,出峰越早(1)总原则一、分配色谱②流动相的选择(2)反相色谱中固定相和流动相的选择与出峰顺序——选择强极性流动性★分离弱极性或非极性化合物如多环芳烃等:用水和极性有机溶剂(如甲醇、乙腈)的混合物为流动相;③洗脱物流出顺序极性大的组分先出峰,极性小的后出峰★分离一些易离解的组分如有机酸、有机碱、酚类。
7、等:用水和极性有机溶剂(如甲醇、乙腈)并添加少量酸或碱的混合溶液为流动相;一、分配色谱——固定相与流动相的选择及洗脱顺序①固定相以硅胶为基质的C18(ODS柱)、C8以及C1、C2、C4、C6、C12、C16、C22和C36等柱——非极性化学键合固定相(3)正相色谱中流动相的选择与出峰顺序——选择非极性或弱极性流动性★用非极性或弱极性溶剂(如正己烷)和适量的极性溶剂(如乙醚、醇、乙腈、氯仿等)混合物作流动相;分离极性化合物特别是异构体和不同类型的化合物极性小的组分先出峰,极性大的后出峰一、分配色谱——固定相与流动相的选择及洗脱顺序①固定相——一般为硅胶柱或键合极性柱②流动相的选择③洗脱物流出顺序二、吸附色谱以固体吸附剂(如硅胶、氧化铝等)作为固定相,依据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的液相色谱对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂;对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。1、定义与原理2、流动相的选择3、应用可用于分离能溶解在非极性溶剂中,具有中等分子量的非离子型试样特别是异构体三、离子交换色谱法固定相为离子交换树脂,流动相为无机酸或无机碱的水溶液,依据各种离子与树脂上交换基团的交换能。
8、力的不同进行分离的液相色谱1、定义与原理2、固定相在载体(合成树脂如聚苯乙烯、纤维素和硅胶等)上键合离子交换基团得到树脂上常用的离子交换基团3、应用可用于所有在一定条件下带电荷的物质如无机离子、有机物酸碱及氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子的分离测定四、凝胶色谱法1、定义与原理3、常用凝胶4、应用分离高分子(M2000)的化合物以多孔凝胶为固定相,依据组分分子大小和形状的不同进行分离的液相色谱法。比凝胶孔径大的分子不能进入孔穴中而被排阻,最早出峰,比凝胶孔径小得多的小分子则完全渗透,最后流出色谱柱,中等大小的分子部分渗透,则按其分子大小,分子量大的先后从柱中流出。2、出峰顺序类型材料型号特点流动相葡萄糖凝胶Sephadax水软性凝胶聚苯乙烯Bio-head-S溶胀,小分子分离有机溶剂聚苯乙烯Styragel有机溶剂半刚性凝胶聚乙酸酯Emgel(OR)溶胀较小流速较小有机溶剂玻璃珠CPG-10有机溶剂和水刚性凝胶多孔硅胶Porasil刚性大、高流速分离有机溶剂和水亲水性凝胶疏水性凝胶无机凝胶五、各种色谱方法适用的大致试样范围极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反相分配分配正向分配。
9、离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量本章作业pp593-594:1、2、4、5、12、20补充题:简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素,如何减少谱带扩宽,提高柱效?。
本文标题:第14章液相色谱法
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