第2章蛋白质测序分离及提纯

2.6蛋白质的理化性质与测序蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定胶体性质沉淀反应：盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀变性、复性水解颜色反应2.6.1蛋白质的性质2.6.2蛋白质的胶体性质（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀蛋白质溶液有胶体溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。蛋白质是相对分子质量很大的生物分子,相对分子质量一般在10000～1000000之间或更大一些.+++++++++++++++++++++++++++2.6.3变性、复性（1）变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。使蛋白质变性的因素（1）物理因素：高温、高压、超声波、紫外线射线等（2）化学因素：有机溶剂、强酸、强碱、重金属盐等变性的本质：分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。蛋白质变性后的表现：（1）生物学活性消失（2）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。（2）复性：去除变性因素回复原来结构与功能。变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。（3）应用①利用变性：酒精消毒高压灭菌②防止变性：低温保存生物制品③取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)2.6.4蛋白质的沉淀蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀（1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出（2）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱（3）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱蛋白质在溶液中维持稳定的因素：表面电荷、水化层（溶剂化层）变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ①.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性②.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用③.等电点沉淀④.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐⑤.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐⑥.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态2.6.5蛋白质主要呈色反应双缩脲反应酚试剂反应→蛋白质定量、定性茚三酮反应测定常用方法双缩脲反应(碱性溶液)Cu2+红紫色络合物蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物Folin(福林试剂）-酚试剂反应蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的酚基在碱性条件下与福林试剂的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两层之间就会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。坂口反应精氨酸分子中含有脈基，能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及ɑ-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质。米伦反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类公化合物有此反应。紫外吸收蛋白质分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，这些氨基酸的侧链基团具有紫外光吸收能力，最大吸收峰在在280nm处，故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。2.7蛋白质分离提纯及分析技术2.7.1蛋白质分子量及其确定方法蛋白质相对分子量在6000～1000000之间。测定分子量的主要方法有化学组成法、渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。化学组成法:最低M=元素(分子)分子量/元素(分子)百分含量渗透压法:Mr=cRT/Π超离心法:Mr=RTs/[(1-υρ)D]凝胶过滤:logMr=K1-K2VeSDS－PAGE法:logMr=α-bμR氨基酸序列分析计算元素原子量(分子分子量)最低相对分子量=元素(分子)百分含量肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可按下式算出：Fe原子量(55.8)最低相对分子量=Fe元素百分含量(0.335%)=16700化学组成测定最低相对分子量真实分子量是最低相对分子质量的n倍，这里n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因为肌红蛋白中，n＝l，所以其真实Mr就是16700。又如血红蛋白含铁也是0.335%，即最低Mr亦为16700，但根据其他方法测得的Mr是68000。可见每一分子血红蛋白含有四个铁原子，即n＝4，因此其真实Mr＝16700×4=66800。有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200。用其他方法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。2.7.2蛋白质纯化总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶（一）利用溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀和pH控制当蛋白质处于等电点pH值，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理可以把蛋白质混合物分离开来。蛋白质混合物的分离纯化方法2.蛋白质的盐溶和盐析中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象称盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。3.有机溶剂分级法有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。（二）根据分子大小不同的分离方法1.过滤与膜分离借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。2.离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力达到1×104～1×105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。3.凝胶过滤层析（gel-filtrationchromatography）凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。（三）根据电荷不同进行分离1.电泳带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。1）区带电泳是由于在支持物上电泳时各组分因迁移速度不同分布成区带而的名。区带电泳按其支持介质的物理性质不同可以分为四类：（1）纸电泳和聚酰胺薄膜电泳；（2）粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉与适当的溶剂调和而成，铺设成平板；（3）细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝；（4）凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide，Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合形成的三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。凝胶的浓度和孔径可调节。2.离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。（四）蛋白质的选择吸附某些物质对蛋白质有选择吸附，利用对不同的蛋白质的吸附能力不同而得到分离。常用的吸附剂有结晶磷酸钙。（五）亲和层析亲和层析（affinitychromatography)是一种有效分离蛋白质的层析方法，它经常只需要一步即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，并且纯度很高。亲和层析是基于某种蛋白质的生物特异性，即它与另外一种称配基的分子能特异而非共价结合。2.7.3蛋白质一级结构的测定蛋白质中氨基酸的排列顺序。（一）蛋白质顺序测定基本战略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质(2)断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(3)氨基酸组成分析测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比(