第六章毒理学的研

幻灯片1第六章毒理学的研究与方法一、急性毒性试验二、亚慢性毒性试验三、蓄积性毒性试验四、慢性毒性试验五、致癌试验六、致畸试验七、致突变试验幻灯片2一、急性毒性试验急性毒性试验是一次(指瞬间给实验动染毒,如经PO、注射染毒，但经R道与皮肤染毒，则指在一个特定的期限内使实验动物持续地接触化学物的过程，所以一次含有时间的因素)或在24小时内多次（当化合物毒性过低，需给予实验动物较大剂量时，则需在24h内多次染毒，即多次）染毒的条件下研究化学物质毒性作用的一种试验方法（给予受试物后，动物所产生的快速而剧烈的毒性反应）。试验期通常为7~14天幻灯片31．研究目的①测定化学物的半数致死剂量或浓度，估计其毒性大小。②揭示毒作用的靶器官和敏感动物。③观察毒效应的特征。④为亚急性和慢性毒性试验提供剂量设计依据。幻灯片42．试验设计（1）试验动物的选择最理想的试验动物是选择最终应用或接触受试物的动物。但往往由于动物的价格，来源，管理的难易程度等因素而受到限制。急性毒性试验选用的动物可分为两大类，啮齿类动物最常用的是小鼠或大鼠,因经济易得，操作方便，而且用这些动物所做的毒理研究资料较多，有利于化学物的相互毒性比较。幻灯片5家兔、豚鼠也可选用，特别是经皮肤接触的毒作用试验。非啮齿类动物，有犬、猫等，往往因条件限制，不能大数量使用，一般不用其测定外来化学物的LD50，仅用来验证对人或靶动物的毒性或深入探讨化学物的毒效应。幻灯片6（2）性别和年龄由于试验动物的性别、年龄等均可影响外来化学物的毒性，测定LD50时，一般应选用成年动物，雌、雄各半，但当外源化学物的毒性有性别差异时，则需使用雌、雄两种性别的动物分别进行试验。常用实验动物的年龄与体重的选择。小鼠18~20g大鼠180~200g豚鼠200~250g家兔2~2.5Kg犬10~12Kg.幻灯片7(3)染毒途径①经口染毒，指外来化合物经口摄入到胃或用器械直接送入胃的过程，可分为灌胃、混饲（或混饮）和吞咽胶囊等方式。灌胃是将化学物经溶剂溶解后，制成混悬液借助器械直接把受试物灌入胃内，常用的溶剂为水，生理盐水，植物油等，其特点是本身低毒或无毒，与毒物不发生任何反应，由于液体体积可影响毒性，故每一试验中的动物灌胃液量应力求一致。可按单位体重计算灌胃液量。幻灯片8各种试验动物的灌胃液量为小鼠0.1~0.5ml/10g大鼠0.5~1.0ml/100g家兔10ml/2Kg犬50ml/10Kg灌胃优点是剂量准确，缺点是操作麻烦，易造成动物损伤，甚至死亡。多用于急性、亚急性毒性试验。幻灯片9混饲（或混饮）是将受试化学物掺入饲料或饮水中，由试验动物自身摄入，优点是操作简便，接近于自然染毒，缺点是剂量不准确，而且一般都降低了化学物的毒性，因此在急性毒作用试验中不主张采用混饲法，而多用于亚慢性、慢性毒性试验。幻灯片10吞咽胶囊是将受试物装于药用胶囊内，染毒时，将胶囊投放咽部，让其吞咽。优点是剂量准确，适用于易挥发，易水解和有异味的化学物。常用于狗、猫、兔等较大动物，鼠类不用。动物经口染毒前应禁食一夜，以防止胃内食物和充盈度对化学物毒性的影响。幻灯片11②经呼吸道染毒指气态、粉尘状外来化合物经呼吸道吸入或借助器械直接注入气管染毒方法。其方法可分为自然吸入和气管注入。自然吸入又可分为静式吸入和动式吸入。静式吸入是将试验动物置于一定体积的密闭容器内再加入定量的受试物自然吸入，本法设备简单，操作方便，消耗受试物少，有一定使用价值。幻灯片12动式吸入是将试验动物置入空气流动的染毒柜中，使染毒过和中，柜内氧化和二氧化碳分压较恒定，受试物浓度相对稳定，且试验动物的染毒时间不受限制。气管注入是在试验动物处于麻醉情况下，将受试物（粉尘混悬液或液体）注入气管，多用于制造肺脏中毒模型，不用于做化合物的急性毒性试验。幻灯片13③经皮染毒是指将化合物涂于动物体表，以观察化合物的经皮吸收毒性和刺激性。根据试验目的，经皮染毒可分为皮肤吸收试验和局部作用试验。皮肤吸收试验，主要用来测定外来化学物能否经皮肤吸收引起中毒（定性试验），通常用小鼠或大鼠浸尾法测定，皮肤接触外源化合物的时间一般为6~24h。幻灯片14局部作用试验，可用来研究外来化学物对皮肤的局部急性损伤(刺激毒性)，观察皮肤反应（红、斑、焦痂、水肿）按规定指标进行评分。方法有涂布法、斑贴法和兔耳法。动物成年白色家兔，背部脊柱两侧脱毛，面积3×3cm，一侧对照，另一侧试验，接触6h,清洗，观察皮肤反应，按规定评分标准，一般求涂布后24h与72h反应评分的平均值，以此评价化合物皮刺耳激毒性的强度。幻灯片154注射染毒是指将外来化学物用器械直接注入机体某一组织的染毒方法，在毒理学试验中常用的有静脉、肌肉、皮下、皮内和腹腔注射。主要用于各化学物之间的比较毒性研究，化学物的代谢动力学试验，亦可用来估计经口和经皮肤吸收的速率和程度。注射染毒的注射剂量大体范围见下表：幻灯片16几种动物不同注射途径的注射（ml）注射途径小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2~1.01~32~35~105~15肌肉0.1~0.20.2~0.50.2~0.50.5~12~1静注0.2~0.51~21~53~105~15皮下0.1~0.50.5~10.5~21~33~10幻灯片17⑤剂量和动物数对化学物进行急性毒性试验的主要目的，在于测定其半数致死量（LD50），剂量范围的选择要求是先做预试，初步了解试验动物的死亡率为0%~100%的剂量范围，也就是说动物刚好不致死和全部致死的剂量范围，在死亡率0%~100%的剂量范围内，按等比级数进行分组。组间比值为1.2~1.5，试验动物50只以上为宜。同时，每组试验动物应雌雄各半，再一个剂量组内，同性别大鼠和小鼠的个体体重差异应小于10%，各剂量组间同性别动物平均体重波动范围应在5%以内。幻灯片18⑥观察与检查进行急性毒性试验，通常观察7—14天。在观察期内对动物的中毒症状和死亡时间应仔细观察并记录，对每个剂量组一些中毒症状及其发生率的观察，不仅有可能找出化学物毒作用的特征，初步了解到毒作用的靶器官和致死原因，而且可估计某些效应的半数效量。所有死亡动物和部分存活动物要进行大体剖检，剖检可提供有关靶器官的有用资料，确有必要时，亦可选择某些器官和组织进行组织病理学检查。观察期试验动物应保持良好饲养条件，防止意外死亡。幻灯片193．LD50的用途①用LD50进行急性毒性的分级1978年我国对农药提出了一个三级急性毒性分级标准。1978年我国对工业毒物提出一个五级急性毒性分级标准。目前我国食品毒理学借用了国际上六级分级标准。②估计中毒事故的危害程度。③为亚急性和慢性毒性研究提供剂量依据。④提供某特定动物群的反应性资料。⑤作为控制某些化学物质量的一个指标。幻灯片204．LD50的测定方法1）寇氏法（平均致死量法）（1）优缺点优点:方法简便,准确性高。缺点：要进行预试（2）本法实验设计要求①各组动物数相等②正确选择剂量范围③剂量呈等比级数幻灯片21（3）试验方法①预试目的在于正确选择剂量范围使最低剂量组死亡率为0%，最大剂量组的死亡率为100%，过程是在正式试验前将受试物递次稀释3倍，其设三个剂量组，每组三只试验动物，染毒后按规定观察动物死亡和存活情况。（如三组动物全部死亡，则以同样比例稀释后再以三组动物染毒。如三组全部存活，则按比例增加毒物浓度后再用三组动物试验。）直到求出一组动物全部死亡和一组动物全部存活的剂量。以此作为最低和最高致死剂量，在此剂量间做正式试验。幻灯片22②正式试验A．确定各组剂量，在最低、最高致死剂量确定之后，在这个剂量范围内按1：1.2~1.5的比值定出各组剂量。通常设五个剂量组，先计算出相邻两组剂量公比r，r=log-1(),b为最高致死剂量，a为最低致死剂量，n为组数，各组剂量分别为a,ar,ar2,ar3,ar4。1loglognab幻灯片23B．动物染毒各组染毒的条件应当一致，如染毒的速度，毒液的体积。C．试验观察记录在观察期内对各组动物的中毒症状和死亡时间应仔细观察并记录。所有死亡与部分存活动物要进行大体剖检，必要时可进行组织病理学检查。幻灯片24D．LD50计算①编制LD50计算表②代入公式lgLD=Xk-d(∑p-0.5)XK为最大对数剂量d为相邻两组公比的对数幻灯片25③求logLD50的标准误（S）④求LD50的95%可信限501lg1pipiSLDdn150505095%lglg1.96lgLDLDSLD的可信限幻灯片26举例用85%的马拉硫磷对大白鼠灌胃的毒性试验，求LD50。根据试验结果，剂量范围在0.625g-5.0g/Kg,按等比级数分为五个剂量组，先计算公比幻灯片271111lg5000lg6253.702.80lglg5140.9lglg0.231.68184r幻灯片28编制LD50计算表85%马拉硫磷对大白鼠灌胃LD50计算表组别剂量(mg/Kg)对数剂量(X)实验动物数（n）死亡动物数(r)死亡率(pi)Pi+pi+116252．79591000021051．123．02171020．20．231767．773．24741030．30．542973．023．47321070．71．2550003．69910101．02．2合计r22pi2.2幻灯片29代入LD50计算公式求logLD50的标准误（S）求LD50的95%可信限150lg[3.6990.22582.20.5]LD1lg3.315142066.05/mgKg501lg1pipiSLDdn010.20.80.30.70.70.3100.08644444111lg3.315141.960.086lg3.315140.16856lg3.14658~3.48371401.46~3045.79/mgKg幻灯片30二、亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验是研究试验动物连续多日给予较大剂量受试物后，所发生的毒性作用的一种试验方法。幻灯片311．实验目的①了解受试物的中毒反应指标。②测定受试物的靶器官和靶组织。③求出受试物的最大无作用剂量和出现毒作用的最小阈剂量。④确定是否需要进行慢性毒性试验，并为慢性毒性试验的剂量选择提供依据。幻灯片322．试验方法（1）试验动物和数量一般选两类动物进行试验。试验动物的年龄要略低于急性试验要求啮齿类小鼠体重14~17g大鼠体重50~80g兔体重1~2kg非啮齿类犬体重5~8Kg猫体重1~2kg每个剂量组和对照组的动物数大、小白鼠不少于20只，犬、猫、兔不少于4~6只，雌雄各半。幻灯片33（2）染毒途径和剂量亚慢性毒性试验的染毒途径应首选饲喂法，即受试物拌入饲料中令动物自由摄取，有时也可加入饮水中，如这种方法不能采用时，与可用灌胃法，多用于犬，大、小鼠不用。剂量，试验组一般应设三种剂量，即高剂量组，一般要求出现中毒，甚至个别动物死亡，死亡率低于10%。幻灯片34此剂量的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性毒性试验的最高剂量，是以化合物LD50的1/20~1/5来确定。低剂量组，不引起任何毒性作用或有轻微的反应。相当于无作用剂量。一般用LD50的1/80~1/10作为亚慢性试验剂量。另在此两剂量间再设一引起轻度反应的剂量，中等剂量组是探索最大耐受量。在此剂量下不应出现毒性反应，可以LD50的1/10~1/30来确定。另还必须设一个对照组，接受实验组所用的各种赋形剂，对照组有时需设两个，即基础饲料对照组和配制的饲料对照组。幻灯片35（3）观察和检查①一般检查，观察动物的一般活动，症状，死亡情况，对动物在试验期间所出现的中毒症状及先后次序，出现时间