第六节DNA的变性复性

第六节DNA的变性、复性一DNA的变性(denaturation)DNA分子是由两条头尾倒置的脱氧多核苷酸所组成，其中一条链的碱基与另一条的碱基之间有氢键连接，并以A－T，G－C互补，整个DNA分子呈双螺旋结构。在加热、碱性等条件下，链间氢键断裂，形成两条单链结构，这种现象称为DNA变性（denaturation）。DNA在溶液中发生变性伴随着一系列的物理化学性质的改变,如紫外吸收强度的增加,此种现象称增色效应(hyperchromicity)；溶液粘度的降低；沉降速度增加等。这些物理常数常用来研究各种DNA结构和功能。对某一DNA来说，其紫外吸收强度(A260)是双链DNA单链DNA。紫外吸收强度的增加与变性(解链)程度成正比。若将A260的增加作为温度的函数作图，可得解链曲线(图2-18)。DNA的热变性常称为DNA的“融解”（melting），解链曲线的中点所示温度称为Tm或称为融点，Tm表示使50%DNA分子解链的温度。不同种类DNA有不同的解链曲线，也有不同的Tm，Tm随G+C%含量呈线性增加(图2－19)。每增加1%G+C含量，Tm增加约0.4℃，这是由于G/C碱基对之间的氢键多于A/T对之故。溶液的离子强度Tm有较大的影响，单价阳离子浓度每增加10倍，Tm增加16.6℃。某些化学试剂能显著影响Tm值，例如甲酰胺能破坏氢键，使Tm大大降低。图2-18DNA变性过程和变性曲线图2-19G+C含量对变性的影响DNA在变性过程中，其分子量不变，但二级结构中的氢键破坏，在双螺旋解旋分离为两条链的过程中，一级结构中的共价键都不破坏。DNA变性有两个阶段，第一阶段部分解链，已解开部分不规则卷曲；第二阶段为完全解开，形成两条单链，此时若迅速泠却，每条链自身卷曲，部分区域形成链内双螺旋（见图2-20）。第一阶段变形可以逆转，即当温度降低时，已解开的链又会重新盘绕，形成完整的天然双螺旋。第二阶段DNA双链完全分开，很难恢复到天然构型。图2-20DNA热变性过程轻度变性，往往只有A-T分开，G-C不分开，富含A-T的区域就形成小“泡”，富含G-C区域保持双链结构，在电镜中可以可以观察到这种结构，从而推测DNA的结构特征（见图2-21）。已变性的DNA，若两条单链硷基组成不同，嘌呤比例高低不一，分子量和分子密度也就不同，所以可以用密度梯度离心或电泳法将变性后形成的两条单链分离开来。图2-21电子显微镜下的DNA分子的部分变性二DNA复性(renaturation)在去除变性条件下，两条变性的碱基互补的单链DNA可以恢复成双链结构，恢复原有的物理化学特性和生物学活性,这种现象称为DNA复性(renaturation）,或称为退火（annealing）。影响变性与复性过程的主要因素是温度、DNA浓度、复性时间和盐浓度、变性剂浓度。与两条链之间碱基互补的程度当然更有关系。复性的最适宜温度是Tm下25。C，在这温度下不易发生硷基错配和链内硷基配对，如果，加热变性后将变性DNA立即置于冰中，会仍然保持变性状态。一般来说，DNA浓度愈高，复性愈快，因为在一定时间里，互补的单链DNA发生碰撞的几率愈高。时间愈长，发生复性愈多。高盐浓度易于复性，有变性剂存在下，不易复性。一般来说，DNA浓度越高，两条互补单链相遇的几率增加，复性的速率就增加。DNA复性决定于互补单链DNA的随机碰撞,是双分子反应，服从二级反应动力学规律,反应速率可用下式表述:dC/dt=kC2(1)C代表在t时间单链DNA的浓度,k为复性速度常数。对(1)式进行积分:C/Co=1/(1+kCot)(2)当反应进行到一半时,即在t1/2时,式(2)变成C/Co=1/2=1/(1+kCot1/2)(3)简化成Cot1/2=1/k(4)任何DNA的复性都可以用它的速度常数k来描述(单位是浓度-1时间-1)或以速度常数k的倒数即C0t1/2(单位是浓度时间)来表示。从方程(4)可知,控制复性反应的参数是DNA初始浓度(C0)和保温时间(t)的乘积,即C0t，可读作“Cot”，用mol/LS表示。达到半复性时的C0t称为C0t1/2。C0t1/2愈大,反应就愈慢。可以用图2-22的C0t曲线表示DNA复性反应。用已经复性的DNA部分（1-C/C0）对C0t的对数作图。图2-22是几种基因组的C0t曲线，从图中可见每一种曲线的形状相同。反应进行到10%和90%时的两点，C0t值相差100倍。但每一种C0t1/2是不同的。表明复性是单质性的，仅有一种复性速率相同的组分。如果两点的比值大于100倍，表明复性是异质性的，含有两种或两种以上复性速率不同的组分。图2-22DNA复性速率与其长度成正比C0t1/2值同基因组中DNA量直接有关。随着基因组变得更复杂，一定质量中个别DNA顺序的拷贝数会愈少。例如DNA的C0.为12pg（1pg约1X109bp），若细菌基因组的大小为0.004pg(约4X106bp)，那么12pg的DNA中细菌基因组每一种顺序有3000拷贝（12pg/0.004pg=3000）,若大小为3pg（约3X109bp）真核基因组，那么12pg的DNA中，真核基因组的每一种顺序仅有4个拷贝。因此同样浓度的DNA，在真核基因组中每一种顺序的频率比细菌要低5楷。因为复性反应的速率取决于互补顺序的频率，如果真核基因组中的一种顺序频率要达到同细菌基因组的一种顺序相同，那麽真核基因的DNA浓度就要比细菌大750倍，或者，相同量的DNA耍达到相同的复性程度，反应时间就要延长750倍。因此，真核细胞DNA复性反应的C0t1/2是细菌的750倍。在不存在重复序列的情况下，DNA的C0t1/2值与基因组大小呈正比。因此C0t1/2值可以用来表示反应体系中存在的不同序列DNA的总长度。把这个总长度称为复杂性（Complexity），通常是以硷基对数来表示复杂性。任何基因组或它的一部分DNA的复性反应都有一个同它的复杂性成比例的C0t1/2。因此任何DNA的复杂性就可以用它的C0t1/2值同已知其复杂性的标准DNA的C0t1/2相比较来测定。人们通常用大肠杆菌DNA当作标准。大肠杆菌DNA的复杂性就是用它的整个基因组的长度作标准（把大肠杆茵DNA看作都是单拷贝的），即4.2X106bp，可以得出下式：C0t1/2（任何基因组DNA）任何基因组DNA的复杂性-----------------------=---------------------C0t1/2（大肠杆菌DNA）4.2X106bp4.2X106bp×C0t1/2（任何基因组DNA）所以任何基因组DNA的复杂性=---------------------------------------C0t1/2（大肠杆菌DNA）真核基因组合有几种顺序组分：当真核基因组DNA用复性动力学进行鉴定时，发现其复性反应的Co·t值的范围常跨越8个数量级，即从10-4至104，这个数值比方程（2）所预计的100倍要大许多（见图2-23），表明真核基因组DNA的复性反应是异质性的，即其中含有复性速率彼此不同的两个或两个以上的组分。出现这种差异的原因是方程（2）应用于单个动力学纯的组分，相差100倍，但一个基因组实际上包含有几个动力学组分，那么每一种组分都有它自己所特有的复性动力学，那么它们的差值就远远大于100倍。图2-23表示的是真核基因组DNA复性的Cot曲线，其Cot值从10－4到104。复性反应分成三个不同的阶段，第一阶段与第二阶段之间有一个平坦的区域，第二阶段与第三阶段之间有轻微的重叠，每一阶段都代表了基因组不同的动力学组分。第一阶段的组分叫快复性组分，占总DNA的25%，Co·t值在10-4至10-2之间，为0.0013。图2-23真核基因DNA复性动力学第二阶段的组分叫中速复性组分，占总DNA的30%，Cot值在0.2～100之间，Cot1/2为1.9。第三阶段的组分叫慢复性组分，占总DNA的45%，Cot范围在100～10000之间，Cot1/2为630。为了计算这些组分的复杂性，每一种都得以独立的动力学组分来处理，即单独与标准DNA进行比较。慢复性组分占总DNA的45%，那么它的C0就是0.45，其Cot1/2就是0.45×630=283。假定在相同条件下，大肠杆菌DNA的复性反应的Cot1/2是4，，复杂性是4.2×106bp，将各项值代入（5）式，那么4.2×106bp×283慢复性DNA的复杂性=--------------------=3×108bp4用相同的方式处理其余两个组分4．2×106bp×1.9X0.3中速复性的DNA复杂性=--------------------=6×105bp44．2x106bpX0.0013X0.25快速复性的DNA复杂性=--------------------------=340bp4从上面结果可见，一个组分复性愈快，其复杂性就愈小。从非重复顺序DNA的复杂性可以估计出基因组大小。慢复性组分的复杂性相对应于它物理上的大小。假定图2－22中的基因组用化学方法测出其单倍体DNA含量为7×l08bp，那么它的45%就是3．15×l08bp，这同比用动力学方法测得的数值稍大了一点（3×l08bp），但可以看作是相同的。因此，可以说慢复性组分的复杂性无论是用化学方法，还是用动力学方法测定，得到的结果都是相同的。用化学方法恻得的数值叫化学复杂性，用动力学方法测得的数值叫动力学复杂性。这两个数值的一致性意味着慢复性组分含有的DNA顺序在基因组中都是唯一的，即是非重复顺序。在变性以后，每一个单链仅能同它相互补的单链进行复性，在原核细胞中几乎都是唯一的，而在真核细胞中通常不是唯一的，只是占大多数，这部分DNA叫非重复顺序DNA。我们能用非重复顺序DNA的复杂性估计出基因组的大小。例如非重复顺序DNA的复杂性为3×l08bp，这部分DNA占总DNA量的45%，那么，3.0×l08bp×0.45=6.6×108bp，这就是基因组的大小。这就提供了另一个独立的方法来估计基因组的大小。这同化学方法测定的结果（7.0×l08bp）是非常接近的。用动力学测定的复杂性对用化学方法测定的单倍体DNA含量作图，结果非常一致，表明非重复顺序DNA组分都是由在基因组中仅有一个拷贝的DRA顺序组成。在基因组中存在多于一个拷贝的顺序叫重复顺序，仅有一个拷贝的叫非重复顺序。正常情况下，重复频率由下式决定化学复杂性重复频率（f）=-------------------动力学复杂性重复顺序DNA包括所有重复频率显著大于1的组分。例如某一基因组是由单拷贝的Abp长、10个拷贝的Bbp长和100个拷贝的Cbp长三部分组成，其复杂性就是A＋B＋C，其重复频率分别为1、10和100。AbP是非重复顺序，Bbp和Cbp是重复顺序。重复频率1与2之间也属于非重复顺序。从前面提到的例子来看，化学复杂性是3.15×l08bp，动力学复杂性是3.0×l08bp，f=3．15×l08bp/3．0×l08bp=1.05,所以是属于非重复顺序。解离的核酸互补链，重新形成碱基配对的螺旋结构的复性速度取决于下列四个参数：①正离子浓度正离子作为反离子减少两条互补链的磷酸基团的负电荷排斥力，一般复性反应都采用0.18mol／LNa＋浓度，②反应温度复性反应都需要在一定的温度下进行，用以破坏和弱化链内的二级结构。一般复性温度都采用低于该DNATm25℃的温度，即60～65。O℃左右，③DNA浓度DNA复性反应服从于二级反应动力学，所以DNA浓度决定分子间的碰撞频率，影响复性反应的速度。④DNA片段大小。