电镜操作注意事项

扫描电镜样品的制做与观察解放军总医院骨科研究所黄靖香目的随着组织工程技术的发展兴起，如支架材料的制作后，需观察样品中的孔径大小，与细胞的相融性，生长形态变化等。用扫描电镜观察获得清晰图像，是重要的检测手段之一。电子显微镜分透射和扫描电镜两种，透射电镜（TEM）是观察样品中的内部结构：如细胞器等；扫描电镜（SEM）可观察样品中的表面形态结构。扫描电镜的优点景深长，视野广，图像呈三维立体结构，样品制作较透射电子显微镜简单，功能多，根据样品性质不同，其处理方法也有所区别，下面主要介绍组织工程支架、细胞、细胞外基质等样品的制作技术。一.样品制作处理步聚取样→清洗→第一次固定（戊二醛）→第二次固定（锇酸）→缓冲液中漂洗→梯度脱水→醋酸戊酯置换→临界点干燥（改成六甲基二硅胺烷HMDS代替临界点干燥）→表面喷镀→扫描电镜中观察。根椐我们的具体情况加以改进。1.材料准备、液体配制：1）玻璃器皿需泡酸、蒸溜水清冼后灭菌备用。2）磷酸缓冲液（PBS-0.1MPH-7.4）配制：磷酸二氢钠2.964g,磷酸氢二钠29.011g加三蒸水1000ml，也可用不加酚红无菌Dhankes液代替。3）固定液的配制：用PBS缓冲液配成2.5%戍二醛和1%的四氧化锇。2.取材准确、固定及时：尽可能保存原貌，大小适宜（10mm2高5mm左右），对样品表面用无菌Dhankes液清洗2次，迅速用2.5%戍二醛4度下前固定4h以上。3.观察样品前两天，PBS洗20分钟/次×2次，以下均在室温下，通风橱中进行。4．1%四氧化锇酸后固定2h。缺插图托上加图片饿酸固定加图片单宁酸加图片5．重复步骤3。6.2%单宁酸过滤后洗2次，每次30min。7．重复步骤3。8.梯度乙醇脱水（507590100）%×2次，每次30min，也可在75或90%乙醇中过夜。9.醋酸异戊酯置换乙醇40min。10.六甲基二硅胺烷原液（HMDS）5-10min替代临界点干燥，放青霉素瓶中抽真空后密封。11.样品用导电胶贴牢贴平，正面朝上，大小适宜。置蒸空干燥器内过夜。12.第三天早晨，用离子溅射真空镀膜法喷镀导电金属。13.上机观察样品，照相获得二次电子图像。二.比较不同干燥方法的优缺点材料分类A单纯支架材料：看孔隙率和孔径大小分布，用普通冷冻干燥机冷冻干燥法干燥48h的支架→粘贴后→喷金上机观看干燥喷镀上机观察B.活细胞不处理环镜扫描直观看细胞活细胞环镜扫描图C.细胞常规梯度脱水：用冷冻干燥机处理细胞收缩，断裂，立体感差。冷冻干燥细胞裂缝冷冻干燥细胞收缩D.HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架HMDS处理后的图像E.HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架微细结构的观察：纳米材料(ECM)猪ECM胶原犬神经胶原脐带ECM胶原背根神经节基质F.常规脱水临界点干燥处理后的样品和六甲基=硅胺烷（HMDS）处理的比较常规处理HMDS处理三．注意事项和要求1.取材大小适宜，准确定位，首先洗去赘生物后立即固定，防组织细胞的结构自溶或变形。污染物造成图像表面出现絮状物，轮廓不清。2.根据不同样品，采用不同的干燥方法，防止因干燥时间过长，压力过大造成样品过度收缩和断裂。样品厚而贴不牢不平，造成喷镀不均，样品边缘空白，发亮而出现充电现象和边缘效应。图像漂移。为此可降低电压（1-5KV）减少充电和边缘效应。3.用单宁酸的目的为提高二次电子发射率，耐受电子轰击，防止样品断裂。4.样品脱水干燥贴牢后，需放置玻璃密封真空（加干燥剂）干燥器皿内。样品喷镀后，最好当天观察，照相,如看不完，还需放干燥器中密封真空保存，防灰尘潮气进入。最好勿超过3个月。5.因条件有限，无临界点干燥仪，我们采用六甲基二胺烷（HMDS）代替临界点干燥仪，优点是快速经济，不受仪器限制，看普通标本，组织细胞支架材料，与常规临界点干燥处理效果基本一致；看精细材料（ECM）的分辨率还是有差距。6.胶原纤维样品梯度脱水前的漂洗液我们采用无菌的三蒸水洗2次，防止盐结晶沉积在样品表面，影响与超微纳米胶原的混淆。