第十五章分子杂交技术讲稿

1第十五章分子杂交技术第一节核酸杂交的基本原理1、核酸分子杂交定义：在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链（heteroduplex）（参照图讲解）。2、探针技术2.1探针(probe)定义：一段常用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在（参照图讲解）。2.2探针形式（举例说明）3、核酸的变性在物理或化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为核酸的变性（denaturation）。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。加热变性是实验室最常用的方法一般当温度在70℃以内时，DNA几乎不变性；温度在70～90℃之间时，DNA部分变性；温度大于90℃时，DNA变性使双链打开，温度大于100℃时，DNA双链分离。增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。在热变性过程中，通常将增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度或融解温度（meltingtemperature），用Tm表示。影响Tm值的因素：（1）碱基的组成：GC含量愈高的DNA不易变化，其Tm值愈高。在标准条件下即0.15mol/LNacl0.15mol/L柠檬酸钠溶液中（1×ssc），Tm值与碱基对组成之间的经验公式是：Tm=69.3+0.14（G+C）%Tm值还与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，Tm值越大。（2）溶液的离子强度：在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。（3）pH值：核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。2（4）变性剂：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、二甲基亚砜等，可降低Tm值。（5）其它：RNA变性转变不如DNA明显.二、核酸的复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。影响DNA复性速度的因素：主要为DNA样品的性质，如简单序列的DNA要比顺序复杂的DNA复性快；DNA浓度高，使分子之间碰撞机会增加，复性快；长的DNA分子运动慢，复性速度低，复性最快的DNA片段为基因组中的高度重复序列。复性可分为两个阶段：首先是成核，其次是拉链式。复性反应速度1.用Cot值来衡量，它是DNA分子的起始浓度Co(以mol/L表示)与复性时间（t）的乘积，单位是mol.Sec.L-1。2.任何DNA的复性都可用Cot1/2表示，Cot1/2越大，复性反应越慢。3．核酸的杂交及影响杂交的因素3.1温度与时间杂交反应温度一般低于Tm10～15℃。核苷酸杂交的有效反应时间从理论上讲，在3h左右。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜。（具体实验具体对待）。3.2离子强度在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。在进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐酸浓度和洗膜溶液的盐浓度。3.3探针的浓度和长度：探针长度控制在50～300bp为好。双链探针的浓度一般为0.1-0.5μg/ml。杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也增加。3.4非特异性杂交反应为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。常用的封闭物：鲑鱼精子DNA（salmonspermDNA）或小牛胸腺（calfthymusDNA)、Denhardt溶液，也可用脱脂奶粉。3第二节核酸分子杂交技术1、固相分子杂交定义：固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。滤膜杂交的基本过程：该方法分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern印迹杂交和Northern印迹杂交四类。完成一个滤膜杂交实验一般包括的步骤（以Southernblotting为例）：⑴核酸的制备⑵电泳⑶印迹⑷预杂交⑸杂交⑹洗膜⑺检测理想的滤膜应符合以下要求：具有较强的结合核酸分子的能力；与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；与核酸分子结合牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不致于脱落或脱落极少；非特异性吸附少，在漂洗过程中能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；具有良好的机械性能，如柔软性好,韧性强等,以便于操作。目前常用的滤膜有：硝酸纤维素膜（nitrocellulosefiltermembrane）尼龙膜（nylonmembrane）硝酸纤维素膜：用于放射性和非放射性标记探针都很方便，产生的本底浅，经80℃烤干2h和杂交处理后，核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合，这在使用非同位素探针中尤为有用。硝酸纤维素膜的缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓度盐（＞10×SSC），与小片段核酸（＜200bp）结合不牢，质地脆，不易操作。尼龙膜：强度大、耐用，可反复使用。比硝酸纤维素膜具有较强的结合核酸的能力。缺点是对蛋白有高亲合力，不宜使用非同位素探针。以哺乳动物基因组DNA为例，介绍southern印迹杂交的几个基本步骤。41.1.1待测样品的制备（1）制备待测DNA较理想的DNA样品应达到：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过度浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染与干扰。（2）DNA的限制酶消化通常用限制酶消化DNA，一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。1.1.2待测DNA样品的电泳分离采用琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA的酶切片段。凝胶浓度取决于欲鉴定DNA片段的长度，大片段的DNA采用低浓度胶，小片段DNA采用高浓度胶，浓度为0.8%的胶能有效分离1～20kb的片段。含DNA片段的琼脂糖凝胶进行碱变性及中和处理。将凝胶置于碱溶液中浸泡，使DNA变性断裂，形成较短的单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。将凝胶中的DNA片段转移到膜上的过程中，最重要的是要保持各片段的相对位置不变。1.1.3将凝胶中的核酸片段印迹到滤膜上的方法有：毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法。（1）毛细管虹吸印迹法这是一传统方法，本法不需特殊装置，器具简单，缺点是转移时间较长，转移后杂交信号较弱。（2）电转印法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。一般2-3小时内可转移完毕。电转法不宜采用NC膜，一般使用尼龙膜。此外，电转过程中转移体系的温度升高，必须使用循环冷却水。转移大片段DNA效果明显。（3）真空转移这一方法的最大优点是快速高效，可在转膜的同时进行DNA的变性与中和，30分钟至1小时可完成，缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。1.1.4探针的制备可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段，大多数通过克隆或PCR获得的DNA都用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针，探针可用核素标记，也可用非核素标记。1.1.5杂交基本过程相同，即预杂交、杂交、洗膜。5杂交时间、杂交液体系、杂交温度等需根据情况调整。1.1.6杂交结果的检测采用核素标记的探针或发光剂标记的探针;采用非核素标记的探针进行杂交时，可直接在膜上显色，显出杂交条带。1.1.7Southern杂交的应用范围主要用于基因组中特定基因的定性和定量，基因突变分析等。1.2Northern印迹杂交Northern印迹杂交是指细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移到固相支持物上与探针杂交的实验技术。1.3Northern印迹与Southern印迹的区别：不需酶切；变性方式不同；RNA远不如DNA稳定，很容易被RNA酶降解.RNA变性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链。1.4斑点及狭缝印迹杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。1.5原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为insituhybridization。同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，而是在组织和细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量的特异方法之一，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。原位杂交步骤：1.5.1组织或细胞的固定原位杂交主要是在载玻片上进行，载玻片的处理至关重要。固定液的选择（应具备）：⑴能更好地保持组织细胞的形态；⑵对核酸无抽提修饰、降解作用；⑶不改变核酸在组织细胞内的位置；⑷不影响靶核酸与探针的结合；⑸对杂交信号无遮蔽作用。固定时间视材料不同而定，固定细胞时一般为室温30分钟，固定组织则为室温1小时，固定时间太短，会使组织细胞固定不良，影响形态结构及核酸的保存；时间过长，可能会减低靶核酸对探针的可及性，使杂交信号减弱。1.5.2组织和细胞杂交前的预处理杂交前必须用去垢剂和/或蛋白酶对组织细胞进行部分消化，以去除核酸表面的蛋白质，使探针易与靶核酸杂交，Triton-X-100和SDS是常用的去垢剂，目的是增加组织6细胞通透性，利于探针进入组织细胞。要特别注意掌握蛋白酶K消化的程度，过度消化同样会引起组织形态结构的破坏及靶核酸的减少，还会导致标本从载玻片上脱落。1.5.3探针的选择和标记用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。探针的长度选择对结果有一定影响，通常探针的长度以50～300bp为宜，也可以是寡核苷酸探针，这样的探针，穿透能力强，杂交效率高。1.5.4杂交原位杂交是在载玻片上进行，杂交液的体积应尽量少，一般每张切片用10～20μl杂交液为宜，杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及非特异性DNA，各有其作用。1.5.5杂交结果的检测若应用放射性核素（同位素）标记探针，杂交后须经放射自显影，以对被检测的核酸进行定位与定量；若所用的非放射性标记的探针，则根据标记体系对杂交结果进行检测。2、液相杂交液相杂交是指待测的核酸分子和标记的探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。近年发展的核酸酶S1保护分析法等检测RNA的技术均是以液相杂交为基础的。2.1RNA酶保护分析法（RNaseprotectionassary,RPA）其原理是体外转录合成一个高比放射活性的单链RNA探针，此探针与待测RNA互补，二者杂交后，用RNaseA和RNaseT1消化，未形成双链的RNA单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链RNA受到保护，不被核酸酶水解，通过电泳进行RNA：RNA杂交体的检测，此法可用于mRNA定量、mRNA未端定位及确定内含子相应基因中的位置等。2.2核酸酶S1保护分析法是一种比Northern印迹杂交敏感性更高的检测RNA的方法，可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。其原理与RNase保护分析法类似。核酸酶S1能降解单链DNA和RNA.2.3引物延伸分析法引物延伸分析法可用于RNA5’端的定位及mRNA的定量，还可检测mRNA的前体和