反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用-张伟清

药学学报ActaPharmaceuticaSinica2010,45(5):555−559·555·反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用张伟清,胡昌勤*(中国药品生物制品检定所,北京100050)摘要:反相HPLC分析中色谱柱的选择性受到了越来越多的关注,在这些色谱柱中,C18柱是目前最常用的色谱柱,然而各种C18色谱柱在分离效果上也存在着较大差异,因此能否找到合适的C18柱关系到整个实验的成败。经过近年来的研究,已形成了一些色谱柱分类、选择方法,如色谱柱参数(H,S,A,B,C)法、相似系数(F值)法等,减少了色谱柱选择的盲目性。本文结合近年来的研究,归纳了这些方法的优点及其在应用过程中的局限性,并基于前人的理论,结合实际工作,为药品分析中合理选择色谱柱提出了建议和方法。关键词:反相HPLC;C18柱;选择性;相似度中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0513-4870(2010)05-0555-05TheoryofselectivityofRP-LCC18columnanditsapplicationZHANGWei-qing,HUChang-qin*(NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China)Abstract:Inrecentyears,moreandmoreresearchersfocusontheselectivityofRP-HPLCcolumns.Amongthesecolumns,C18columnisthemostcommonlyusedthecolumn.Yeteventhesamefillercannotgiveusthesameseparationeffectwiththecolumnsofdifferentbrandsanddifferenttypes,therefore,itisimportanttochoosethesuitableHPLCcolumnforcarryingoutanexperiment.Afterstudyinrecentyears,somecolumnclassification,selectionmethods(e.g.:columnparametermethod,Fvaluemethod)havebeenachievedandcontributedtothefindingofsuitablecolumnsandreducingtheblindnessofcolumnselection.Thispapersummarizestheadvantagesofthesemethodsandtheirlimitationsintheapplicationprocess,andgivessomeadvicesandexpectationstopharmaceuticalanalysisworksbasedontheworksofotherresearchers.Keywords:RP-HPLC;C18column;selectivity;similarity高效液相色谱法(HPLC)作为各国药典收录的常规分析方法以其高效、灵敏和选择性好等特点广泛用于药物原料及其制剂的含量和杂质分析。在实际工作中,对高效液相色谱法,尤其是反相高效液相色谱法来说,色谱柱的选择是一项十分重要的工作,能否找到合适的色谱柱,关系到整个分析工作的成败。C18柱是目前最常用的色谱柱,市场上有600多种C18色谱柱,且不断有新的色谱柱出现。采用不同的色谱柱分析具体样品时,由于色谱柱选择性的差异,溶质的保留值、色谱峰之间的分离度甚至色谱峰顺序都可能收稿日期:2009-09-24.*通讯作者Tel:86-10-67095308,E-mail:[e-mail]出现较大的差异[1,2]。各国药典目前仅给出C18色谱柱的简单信息,如中国药典中的“用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂”;美国药典(USP)中的“L1填料(octadecylsilanebondedsilicagel)”等未对C18色谱柱的具体型号等进行规定和推荐。欧洲药典(EP)中虽然有时还给出色谱柱孔径、颗粒大小、比表面积等信息,但这些物理参数与色谱柱的选择性之间也仅有中度关联或缺乏关联[3]。因此,在实际工作中选择色谱柱时存在一定的盲目性,也给药典方法的执行带来一定难度。在新药研发过程中建立HPLC分析方法时,虽然从药物的相对分子质量及pKa入手,已经有一些经验性的色谱柱选择方法可以参考[4−6],但在针对难分离物质对时,仍需要经过对色谱柱和流动·556·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2010,45(5):555−559相的大量筛选才能完成。目前对色谱柱的性能测试主要有非色谱法(non-chromatographicmethods)和色谱法(chromatographicmethods)两类:非色谱法采用红外光谱和核磁分析等直接分析色谱柱填料的特征;而色谱法则致力于通过将色谱柱对溶质保留值的影响量化,以期直观地反映色谱柱的性能差异。色谱法又可分为经验法(empiricalbasedevaluationmethod)、热动力学法(thermodynamicallybasedmethods)和保留机制法(evaluationmethodbasedonaretentionmodel)[7,8],其中保留机制法已成为近年来的研究热点。本文主要对基于保留机制法的反相色谱柱选择理论及其应用的进展情况进行介绍。1色谱柱选择性参数及其应用1.1基本原理将色谱柱中影响溶质保留值的特征进行量化分类,建立色谱柱参数与色谱柱的选择性之间的联系,进而解决色谱柱的选择问题。Wilson等[9−11]采用67种分子特征差异较大的溶质在10根反相色谱柱上进行保留值测试,结合前人的实验结果(86种溶质,5根C18和C8色谱柱)并进行大量的数学推导变换,得出在形式上和溶剂化方程十分相似的经验性线性自由能方程,用来讨论色谱柱和其他条件对化合物容量因子(k)的影响。log(k/kref)≡logα=η'H+σ'S+β'A+α'B+k'C(1)方程中k和kref分别代表相同色谱条件下待测溶质和参比溶质(常用乙苯)的容量因子;H、S、A、B、C分别代表色谱中当流动相、温度均恒定时色谱柱的疏水性(hydrophobicity)、立体选择性(sterichindrancetoretention)、氢键的酸(hydrogen-bondacidity)、碱性(hydrogen-bondbasicity)和离子交换性参数(cation-exchange/ioninteractionbehavior);η'、σ'、β'、α'、κ'分别代表溶质的疏水性、立体选择性、氢键的酸、碱性和离子交换性参数。从方程(1)中可以看出,溶质在硅胶色谱柱的k由H、S、A、B和C等5个色谱参数所决定。如果利用上述色谱理论对色谱柱进行分类,应用中即可实现快速选择色谱柱的目的。1.2应用Jonathan等[12−14]经过大量实验,得到了158根不同型号色谱柱的色谱柱参数(H,S,A,B,C),并依据色谱柱的发展简史将硅胶色谱柱分为3大类:A型色谱柱(即旧型色谱柱,old-typecolumns)、B型色谱柱(即新型色谱柱,new-typecolumns)和E型色谱柱(即内嵌极性基团或极性基团封尾的色谱柱,embedded-polar-groupcolumns,EPG)。在实践中逐渐总结出各类色谱柱的特点:①A型色谱柱的金属含量较高,硅胶纯度较低。H(疏水性)和S(立体位阻)值较低。而A(氢键酸性)、C(阳离子交换活性)和B(氢键碱性)值相对较高;在低pH缓冲液流动相中加入三乙胺会导致C的增加,而其他色谱柱参数没有本质上的变化,很显然,离子化的三乙胺与离子化的硅醇基作用,使色谱柱上的负电荷减少。②在低pH条件下,E型色谱柱的A、C、H值较低,B值较高。因此,E型色谱柱优先保留苯酚类和羧酸类化合物,而对氢键受体、质子化溶剂如质子化胺以及疏水性强的化合物保留较弱。③在B型色谱柱中很容易找到相似的色谱柱,而在A型色谱柱中,这项工作却很难实现。E型色谱柱在用来分析限定范围内的样品(如自由酸、碱溶质)时具有相似的选择性,而其他情况下相似度较低。目前,与中国药典2005版配套的《中国药品检验标准操作规范》中已应用此分类方法对国内常用的C18柱进行总结,便于实验人员根据被测化合物的特性选择不同类型的色谱柱,从而达到预期的分离分析效果。在实际工作中也已经证明选择相同类型的色谱柱有利于不同实验室间的数据交换[15]。1.3方法局限性上述分类方法虽然建立了5个色谱柱参数与色谱柱选择性之间的初步联系,并根据色谱柱发展简史对色谱柱进行了分类。但该分类方法并没有一个十分明确的指标来衡量色谱柱的选择性,在使用中仍需要使用者依据各自的经验,来判断决定选择哪类色谱柱。Dehouck等[16]曾以欧洲药典中乙酰水杨酸的有关物质分析为例,验证色谱柱分类的必要性和重要性。在所考察的69根C18柱中:①所有250mm的I-a类色谱柱(I-a类色谱柱多数属于B型色谱柱,平均孔径在80～120Å,1Å=0.1nm)、部分I-b类短色谱柱(I-b类色谱柱包括部分A型色谱柱和孔径大于120Å的B型色谱柱等)和所有II-b类色谱柱(属于A型色谱柱)均能将乙酰水杨酸和其已知的杂质完全分离(药典中要求色谱柱的柱长为250mm),而其他类的色谱柱则均不能将上述物质完全分离(分类方法见文献[8,17]);②有5根色谱柱能满足系统适用性实验要求(乙酰水杨酸与水杨酸的分离度应不低于6.0),但并不能将乙酰水杨酸与其已知的6个杂质完全分离;相反有7根色谱柱并不能满足系统适用性实验要求,却能将乙酰水杨酸与上述杂质完全分离。充张伟清等:反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用·557·分说明了色谱柱分类系统的重要性和复杂性。此外,当用统计学方法利用Jonathan等[12−14]得到的色谱柱参数对色谱柱进行聚类分析时(图1),发现A、B和E型色谱柱分散在图1中的各个类中,得不到A、B和E型色谱柱的分类结果。可见,上述分类方法虽然能够对色谱柱的选择提供一定的指导,但仍然需要进一步改进。2利用色谱柱参数的相似度选择色谱柱在方法1的理论基础之上,前人又将相似度的理念引入色谱柱选择,给实验带来了便捷。2.1基本原理在色谱柱参数的基础上,经过大量的实验和数学推导得出了相似度(Fs)公式:Fs=[(H2−H1)2+(S*2−S*1)2+(A2−A1)2+(B2−B1)2+(C2−C1)2]1/2(2)这里的H、S、A、B、C与方程(1)中的意义相同,Fs越小,说明两根色谱柱的选择性越相似,Fs越大,则说明两根色谱柱之间的选择性差异越大。目前,可以利用一些公开发表的文献[18]和数据库[19]中数据,或利用USP网站及一些色谱柱选择软件(如“columnselectorforacd/chemsketch”)查询到多支色谱柱的相似系数。2.2应用2.2.1选择相似的色谱柱不同型号的C18柱在选择性上会存在差异,如果在实验室中想要重现文献或其他实验室的实验结果,除了寻找与文献或其他实验室相同厂家,相同的色谱柱进行实验外,还可以选择与其选择性相似的色谱柱进行实验。方程(2)中的Fs值可以解决这个问题。经过大量实验证明,Fs值越小,说明两根色谱柱之间的选择性越相近。通常当Fs3时,就可以认为它们有相似的选择性。图2是一个含有9种酸、碱和中性化合物的混合物分离分析实例[20,21],从图中可以看出,当Fs=1,2时,出峰的顺序和位置差别不大,而当Fs=10时,出峰的位置,特别是在35min以后的出峰顺序都有较大的差别。因此当要寻找选择性相似的色谱柱时,要选择Fs3的两根色谱柱。2.2.2选择不同的色谱柱在药物分离研究中,经常会遇到两