病毒学11111111

结课论文学号：20114083020狂犬病毒研究的新技术和新方法探讨学生姓名：刘国悦指导教师：于永忠所在学院：生命科学技术学院专业：生物科学中国·大庆2013年11月狂犬病毒研究的新技术和新方法探讨摘要：狂犬病毒（Rabiesvirus,RV）属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。关键词：狂犬病毒，遗传变异，生物学狂犬病毒（Rabiesvirus,RV）是引起狂犬病的病原体。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。病毒颗粒外有囊膜，内有核蛋白壳。囊膜的最外层有由糖蛋白构成的许多纤突，排列比较整齐，此突起具有抗原性，能刺激机体产生中和抗体。病毒含有5种主要蛋白（L、N、G、M1和M2）和2种微小蛋白（P40和P43）。L蛋白呈现转录作用；N蛋白是组成病毒粒子的主要核蛋白，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究；G蛋白是构成病毒表面纤突的糖蛋白，具有凝集红细胞的特性，是狂犬病病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病病毒致病与免疫中起着关键作用；M1蛋白为特异性抗原，并与M2构成细胞表面抗原。1狂犬病毒分子生物学特征1．1狂犬病毒基因组结构狂犬病毒基因组由11928—11932个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，含5个大的开放阅读框编码5种结构蛋白。基因组从3＇端至5＇端的排列顺序为N、M1、M2、G和L基因，分别编码病毒核蛋白（NP）、衣壳基质蛋白（M1P）、膜基质蛋白（M2P）、糖蛋白（GP）和转录酶大蛋白（LP）。每个基因由3＇和5＇端非编码区以及中间的编码区构成。狂犬病毒与其它弹状病毒最明显的不同在于在N基因的3＇端有一段58核苷酸的不翻译先导序列以及在每个结构基因之间的大小和序列不同的不转录的间隔区〔1〕。N基因片段有1424个核苷酸，编码病毒NP，N基因高度保守又高效表达，因此可以广泛用于狂犬病毒感染的诊断和调查。M1基因片段全长911个核苷酸，编码病毒M1P。M2基因片段共有805个核苷酸，编码病毒M2P。G基因片段由1675个核苷酸组成，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共524个氨基酸，编码病毒GP。L基因片段是狂犬病毒基因组中最大的一个片段，全长为6475个核苷酸，编码LP。1．2狂犬病毒毒粒及其多肽研究完整的狂犬病毒粒子由核衣壳和包膜两部分构成，核衣壳由毒粒RNA与三种蛋白结合组成，既NP、LP和M1P；病毒包膜由GP和M2P构成。NP全长450个氨基酸，占狂犬病毒蛋白总量的36％，分子量约50．5kD，C端Ser389为磷酸化位点〔2〕。NP在狂犬病毒复制过程中与基因RNA紧密结合成核糖核蛋白（RNP），保护核酸免遭核酸酶的破坏。在弹状病毒中，NP还与转录和复制的调节有关。在成熟病毒粒子中NP是构成核衣壳螺旋对称结构的主要成分。用单克隆抗体分析NP有3个空间位置明显区别的抗原位点，即：NⅠ、NⅡ和NⅢ，NⅠ和NⅢ分别与374—383和313—337位氨基酸的伸展有关。在NP多肽上还发现一些Th细胞表位，其中404—418位对鼠有保护作用。LP是狂犬病毒最大的结构蛋白，长度为2142个氨基酸，在狂犬病毒基因转录与复制过程中发挥着关键的催化作用。由于其在病毒粒子和感染细胞中仅有少量，因此是在生化和免疫水平上研究最少的狂犬病毒蛋白。M1P是一个高度亲水性蛋白，长度为297或303个氨基酸，其结构的一个重要特点是磷酸化，所以也称其为磷蛋白。磷酸化使其整体上带负电荷，并且负电荷随着高浓度酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸）而增加。M1P与LP相互作用构成了完整的转录酶活性。150个LP分子、约950个M1分子与RNP共同组成30—35圈螺旋状结构的毒粒核心部分——核衣壳，核衣壳具有全部转录与复制活性，可以独立完成基因组RNA的转录和复制，因此核衣壳具有感染性。GP是一种跨膜糖蛋白，构成病毒表面突起（spikes），是狂犬病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病毒致病和免疫中起着关键作用〔3〕。GP全长524个氨基酸，N端19个残基构成疏水性信号肽起始新生蛋白穿过粗而内质网膜。成熟肽从第20个氨基酸Lys开始〔4〕，共含505个残基，分为膜外区：1—439位氨基酸；跨膜区：440—461位氨基酸和膜内区：462—505位氨基酸。不同的毒株其糖基化位点的数目和位置不完全相同，但319位糖基化位点存在于到目前为止测序的所有狂犬病毒中〔5〕，其它位点在不同株之间表现不同。M2P是狂犬病毒最小的结构蛋白，肽链长202个残基，是一种连接蛋白，在核衣壳和病毒膜之间起着媒介作用。由于在1和72残基之间有一个主要抗原决定簇，该部位似乎与宿主对狂犬病的免疫反应有关。中心19个氨基酸片段（89—107位）表现出明显疏水性以锚定蛋白进入病毒膜中。最近对VSV的研究提议M2蛋白从病毒膜内侧伸展到核衣壳螺旋的内核〔6〕，无论M2准确位置是哪，它在病毒形态形成中都起着重要作用。2狂犬病毒感染及发病机理研究狂犬病毒具有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体〔7〕，中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。2．1患者和患病动物体内所分离到的病毒，称为自然病毒或街毒（streevirus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为固定毒（fixedvirus），毒力降低，可以制做疫苗。狂犬病毒不耐热，在56℃时15~30分钟或100℃时2分钟即可灭活；对酸、碱、新洁尔灭、福尔马林等消毒药物敏感；日光、紫外线、超声波、70%酒精、0.01%碘液和1%-2%的肥皂水等亦能使病毒灭活，但在冷冻或冻干状态下可长期保存。狂犬病毒进入人体，沿周围传入神经而到达中枢神经系统，因此头、颈部、上肢等处咬伤和创口面积大而深者发病机会多。狂犬病毒主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染〔8〕。在狂躁型狂犬病患者中，可出现恐水和/或怕风症状，故又称“恐水症”（hydrophobia）。2．2多数动物实验证明，在潜伏期和发病期间并不出现病毒血症，狂犬病的发病过程可分为3个阶段。（一）局部组织内繁殖期病毒自咬伤部位侵入后，于伤口的横纹肌肌梭感受器神经纤维处聚集繁殖，以后再侵入附近的末梢神经。从局部伤口至侵入周围神经的间隔时间一般为3日以内，也有认为病毒在入侵处可停留2周之久，甚或更长（占潜伏期的大部分时间）。（二）侵入中枢神经期病毒沿周围神经的轴索浆向心性扩散，其速度约每小时3mm。到达背根神经节后，病毒即在其内大量繁殖，然后侵入脊髓和整个中枢神经系统，主要侵犯脑和小脑等处的神经元。（三）向各器官扩散期病毒自中枢神经系统向周围神经离心性扩散，侵入各组织与器官，其中尤以唾液神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，临床上可出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。唾液分泌和出汗增多乃交感神经受刺激所致，迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时可引起病人心血管功能紊乱或突然死亡。2．3传播方式1、通过皮肤粘膜感染：（1）咬伤或抓伤。绝大多数狂犬病均为犬、猫咬伤或抓伤所致。（2）在犬、猫等动物的宰杀及剥皮的过程中感染。（3）犬、猫等动物舔伤口或者肛门时感染。（4）犬、猫等动物排出带有病毒的污染物刺伤皮肤感染。（5）护理病人，被其唾液污染手经伤口感染。（6）亲吻犬、猫等动物，通过口腔粘膜感染。2、经呼吸道感染3、经消化道感染4、先天性感染2．4病理变化主要为急性弥漫性脑脊髓炎，尤以与咬伤部位相当的背根节及脊髓段、大脑的海马以及延髓、脑桥、小脑等处为重，脑膜通常无病变。脑实质呈充血、水肿及微小出血，镜下可见非特异性变性和炎症改变、如神经细胞空泡形成、透明变性和染色质分解、血管周围单核细胞浸润等〔9〕。以上病变均属非特异性，而在80%患者的神经细胞胞质中，则可发现一种特异而具诊断价值的嗜酸性包涵体，称为内基氏小体（Negribody）。内基氏小体呈圆形或椭圆形，直径约3～10nm，边缘整齐，内有1-2个状似细胞核的小点，最常见于海马及小脑浦肯野组织的神经细胞中；亦可在大脑皮层的锥细胞层、脊髓神经细胞、后角神经节、视网膜神经细胞层、交感神经节等处检出。内基氏小体实为病毒的集落，电镜下可见小体内含有杆状病毒颗粒。唾液腺肿胀，质柔软，腺泡细胞明显变性，腺组织周围有单核细胞浸润。胰腺腺泡和上皮、胃粘膜壁细胞、肾上腺髓质细胞、肾小管上皮细胞等均可呈急性变性。潜伏期长短不一，多数在3个月以内，国内报告平均66.9天。4-10%病人的潜伏期超过半年，1%超过1年，文献中最长的一例为19年。潜伏期的长短与年龄（儿童较短）、伤口部位（头面部咬伤的发病较早，平均39天，下肢咬伤潜伏期平均90天）、伤口深浅（深者潜伏期短）、入侵病毒的数量及毒力（毒力强者潜伏期短）等因素有关，其他如扩创不彻底、外伤、受寒、过度劳累等，均可能使疾病提前发生。3狂犬病毒遗传变异性研究有效的病毒-媒介结合是由于在分子，生理学及行为方面的相互适应，这种适应可以由于自然或人为的选择压力而改变，从而导致宿主种类的出现或消失。病毒所表现出来的这些改变同时也反应在分子结构上。3．1GP基因遗传变异性研究GP基因可分为4个区：1—57位核苷酸为信号肽编码区，58—1374为膜外区编码区，1375—1440为跨膜区编码区，1441—1575为膜内区编码区，其中膜外区（氨基末端）较膜内区更为保守一些。比较我国人用疫苗株（aG）和国际标准攻击毒株（CVS）、巴斯德株（PV）糖蛋白基因核苷酸序列〔10〕，同源性最大的区域是膜外区（92．8％），最小的是膜内区（78％）。Tordo等根据G基因氨基末端500个核苷酸序列再次对狂犬病毒属进行分类，基因1—4型与血清1—4型一致，基因5和6型与EBL1和EBL2一致。目前还不清楚特异性狂犬病毒血清型是否与特异性疾病形式有关。Mokola病毒引起的疾病其病理表现完全不同于血清一型的街毒株，如：罕见的广泛围脑膜脑炎，但感染组织中尼氏小体数量很少。单克隆抗体研究及交叉保护实验证实Mokola病毒是狂犬相关病毒中与血清一型疫苗株相关最大的一种，分子流行病学调查也证实了这一点。用抗糖蛋白单抗筛选出的CVS—11变异株免疫动物不能保护动物抵抗CVS—11原形株的攻击。用传统狂犬病疫苗免疫的鼠，再用死亡病人分离的毒株攻击，出现了一些免疫失败病例。目前已认识到不同毒株间抗原性结构各有不同，它们仅在NP抗原性上较为一致，GP抗原构和保护力方面存在差别。比较狂犬病毒属中基因型差异较大的2个代表毒株，即狂犬病毒和Mokola病毒基因组，其同源性按下列顺序递减：NP（80％），M2（76％），GP（58％）及M1（45％）〔11〕，在免疫原部位的变异可以解释在血清一型疫苗株和其它型毒株之间缺乏交叉保护的原因。目前认为Arg333是决定GP毒力的关键残基。但病毒与受体的相互作用是极其复杂的。在基因Ⅰ型病毒中，神经毒似乎直接与333位精氨酸或赖氨酸的存在有关，该位置氨基酸的突变则不能感染一定类型的神经原，推测原因是突变后不能识别受体。然而高度致神经病变的Mokola株却在333位有一天门冬氨酸残基。明玉文等〔12〕将aG糖蛋白膜外区基因进行了克隆和序列分析，发现其成熟肽推导的182位和183位的Asn和Pro分别被Ile和Len所替代，导致了AcHr结合序列的构象改变，认为可能是造成aG毒力减弱的分子基础，提示组织特异性可能是非常复杂的。相信随着新的科学知识与技术的发展和应用，有