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病毒诱导的基因沉默摘要:病毒诱导基因沉默(Virusinducedgenesilencing,VIGS)是近年发现的一种转录后基因沉默的现象,是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术,近年来成为植物基因功能研究的有力工具。文章从病毒诱导基因沉默的发现、类型、作用机制、优势及不足、影响条件及对发展前景的展望等方面进行了综述。关键词:病毒诱导的基因沉默;机制;应用;基因功能因功能RNA介导的基因沉默(RNA-mediatedgenesilencing)是一种通过核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制,它广泛存在于各种生物中,在植物中称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)[1]。病毒诱导的基因沉默(Virusinducedgenesilencing,VIGS)属于转录后的基因沉默,指携带植物功能基因cDNA片段的重组病毒,在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变,可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功能.VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术,发展迅速,已广泛应用于生物学诸多领域的研究。1VIGS的建立与发展VIGS一词最早出现于vanKammen[2]对病毒侵染后产生的回复现象的描述,现已成为描述应用重组病毒抑制内源基因表达的专门词汇[3]。最早的VIGS体系采用的病毒载体是典型的RNA病毒。1995年,Kumagai等人[4]在烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)上插入了一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)cDNA片段,当TMV重组病毒侵染烟草后,侵染植物的叶片变成白色,研究表明被感染植株产生的白化效应是因为PDSmRNA水平显著降低引起的。PDS是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶,而类胡萝卜素在植物中具有光保护的作用,类胡萝卜素合成途径被阻断导致植物光保护功能的丧失,从而引起白化效应。1998年,Baulcombe研究组[5]在马铃薯X病毒(PotatoXvirus,PVX)基因组上同样插入了一段PDScDNA,重组病毒侵染植物后也出现了失去光保护作用的白化效应,由此他们提出VIGS可以有效地抑制植物内源基因的表达,从而可以利用病毒载体进行未知基因的功能鉴定。2001年,Baulcombe研究组[6]又报道了以烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)为载体的VIGS体系,发现无论在抑制转基因还是内源基因的表达上,TRV载体诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX载体,TRV本身产生的症状也轻于PVX。目前,TRV病毒载体已在番茄(Solanumlycopersicum)、烟草(Nicotinaspp.)、矮牵牛(Petuniahybrida)、辣椒(Capsicumspp.)、拟南芥和棉花(Gossypiumspp.)等多种植物上被广泛应用。1998年,Robertson研究组[6]利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV)初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默来研究植物基因组功能的体系。利用TGMV的DNA-A为载体在本氏烟上先后成功诱导了镁离子螯合酶的关键基因Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因(luc)发生沉默,从而在叶片上出现黄色突变表型和转luc基因植株不再发出荧光。随后,非洲木薯花叶病毒(Africancassavamosaicvirus,ACMV)和棉花皱缩病毒(Cottonleafcrumplevirus,CLCrV)载体相继在木薯和棉花中得到成功应用,这可能将极大地促进木薯和棉花的功能基因研究[7,8]。继RNA病毒和DNA病毒作为载体的VIGS体系之后,Gossele等人[9]又发展了一种基于卫星病毒的VIGS体系,他们对伴随TMVU2的卫星病毒(STMV)基因组进行了改造,使其具有插入外源片段的能力,通过在烟草上对PDS等13个植物内源基因的测试结果表明,STMV载体能够有效抑制这些基因的表达并呈现明显的表型突变。由于卫星病毒的基因组具有在植物中复制水平高以及本身基因组小,且在实验中容易操作等特点,使其成为一种优良的候选沉默载体。2VIGS的作用机制基因沉默在生物中普遍存在,其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵,识别并抑制外源基因表达,维持生物基因组稳定性等(Baulcombe,2004)。VIGS作为基因沉默的特殊形式,是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后,在复制与表达过程中通常会形成双链RNA(DoublestrandedRNA,dsRNA)形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子,首先在细胞中被类似RNaseⅢ家族特异性核酸内切酶Dicer类似物(如DCL4)切割成21~24nt的小分子干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)(Llave,2010)。siRNAs在植物细胞内被依赖RNA的RNA聚合酶1(RNA-dependentRNApolymerase1,RDR1)、RDR2或RDR6进一步扩增(Donaireetal.,2008),并以单链形式与Agronaute1(AGO1)蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),RISC特异地与细胞质中的同源RNA互作,导致同源RNA降解,从而发生转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)(Brodersenetal.,2008;Qu&Morris,2008;Llave,2010);RISC特异地与细胞核内同源DNA相互作用导致其被甲基化等修饰,从而发生转录水平的基因沉默(Transcriptionalgenesilencing,TGS)(Zhengetal.2007;Llave,2010)。3VIGS类型3.1RNA病毒诱导的基因沉默RNA病毒诱导的基因沉默是目前研究比较深入的一种基因沉默。2001年,Ratcliffetal[10]报道了以烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)为载体的VIGS体系,并比较了TRV和PVX诱导转基因GFP、转基因GUS、内源基因PDS、Rubisco小亚基和LEAFY开花基因发生基因沉默的效率和持续时间,研究发现无论在抑制转基因还是内源基因的表达上,TRV诱导基因沉默的效率和持续性都优于PVX,同时,TRV产生的病毒症状也轻于PVX。2002年,Holzbergetal[11]以大麦条纹花叶病毒(Barleystripemosaicvirus,BSMV)为载体,首次在单子叶植物大麦上成功抑制了PDS基因的表达。2004年,又报道了以豌豆早枯病毒(Peaearlybrowningvirus,PEBV)为载体的VIGS体系,这是第1个可应用于豆科植物基因沉默的VIGS载体[12]。其中,TRV是应用最广的VIGS载体,被应用于本氏烟、番茄、拟南芥和马铃薯等多种植物。该载体目前有3个版本,即最早由Ratcliffetal构建的版本、Liuetal[13]改进的版本pYL156和pYL279,以及Valen2tineetal[14]的TRV22b版本。其中,Liuetal的版本插入了双倍CaMV35S启动子,在C端插入了1个核酶,可导致更有效的病毒RNA的产生;而TRV22b与前2个版本的区别在于TRV22b保留了TRVRNA2中的2b基因序列。不同版本的TRV载体在适用植物范围以及可沉默植物组织等方面有显著区别。Ratcliffetal的版本目前只用于本氏烟(Nicotianabenthamiana)和茄属(Solanum)的3个种;而pYL156则除了应用在本氏烟和茄属的2个种外;还适用于番茄、烟草、辣椒等作物,但不能诱发马铃薯栽培品种卡拉产生有效的基因沉默[15]。而TRV22b则导致植物根部和顶端分生组织中产生比上述2种TRV更好的基因沉默效果。3.2其它病毒诱导的基因沉默与上述RNA病毒类似,DNA病毒也能诱导基因沉默。1998年,北卡罗那州立大学Robertson研究组[16]利用双生病毒科的番茄金花叶病毒(Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV)DNA2A为载体,在本氏烟上成功诱导了镁离子螯合酶关键基因Su(Sulfur)和转基因luc荧光蛋白基因沉默,从而初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默研究植物病毒功能的体系。但是TGMVDNA2A载体诱导基因沉默后的效率比较低,并且病毒本身会产生严重的病毒症状。因此在2001年,Robertson研究组[17]又报道了以TGMVDNA2B为载体的VIGS体系,该载体在基因沉默效率和持久性上都比DNA2A强,在植株中产生的病毒症状也有所减轻。2002年,Turnageetal[18]利用甘蓝曲叶病毒(Cabbageleafcurlvirus,CbLCV)在拟南芥上成功建立了VIGS体系。非洲木薯花叶病毒(Africancassavamosaicvirus,ACMV)也是最近报道的VIGS载体。上述3种均为单链环形DNA病毒,由DNA2A和DNA2B2种组分组成,已分别被应用于本氏烟、拟南芥和木薯的基因沉默研究[19]。与RNA病毒类VIGS载体相比,DNA病毒类VIGS载体的优点是侵染性克隆构建简单,无需转录,稳定,易于操作,但基因沉默效果不如RNA病毒类VIGS载体。以RNA病毒和DNA病毒为载体的VIGS体系建立后,2002年,Gosseleetal[20]对TMVU2的卫星病毒(Tobaccomosaicsatellitevirus,TMSV)基因组进行改造,使其具有插入外源片段的能力,从而建立了一种基于卫星病毒的VIGS体系。该体系能有效地抑制烟草PDS等13个植物内源基因的表达并呈现明显的突变表型。2004年,陶小荣等[21]在对中国番茄黄曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)的研究中,分离和鉴定了一种新型的DNA卫星分子(DNAβ),并对DNAβ上的βC1基因进行了缺失和引入多克隆位点(multiplecloningsites,MCS),将其改造成为一种DNA卫星载体。该载体可以有效地抑制转基因GFP的表达,也可以高效地抑制内源基因PDS和Su的表达,可应用于多种茄科植物的VIGS分析[21-24]。同时,该载体自身基因组小,载体构建操作相对容易,且对高温不敏感,非常适用于维管束组织特异性表达基因的VIGS分析[23,24]。4VIGS有关的实验方法4.1VIGS环境条件的控制成功的基因沉默依赖于病毒在植物体内的传播和植物生长之间的相互作用,而这2个方面都受到环境条件的影响(Burch-Smith等2004)。对于病毒的传播和有效的沉默,温度是最重要的影响因子之一。而对于不同的植物,有效沉默所需要的温度也可能不同。例如,用TRV感染番茄,较好的沉默表型在22℃或更低的温度下发生;而用TRV感染烟草,合适的温度则在25℃左右(Burch-Smith等2004;Ekengren等2003;Liu等2002a;Nethra等2006)。目前的研究证明,植物培养室(growthchamber)是进行VIGS实验较为理想的选择,而控温较差和温度波动大的温室不适宜于做VIGS实验。另外,Fu等(2006)发现,低温和低湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持续时间。4.2设计合理的实验对照对于每个VIGS实验,都必须要有合适的对照来监控沉默的效果。阳性对照通常采用八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)基因的沉默,因为PDS沉默能引起沉默区域发生光漂白,并迅速产生可见的表型(Kumagai1995)。也有一些研究选用镁离子螯合酶(magnesiumchelatase)基因作为阳性对照(Kjemtrup等1998;Peele等200
本文标题:病毒诱导的基因沉默
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