第十章单克隆抗体技术

·1·第十章单克隆抗体技术（Monoclonalantibodytechnique）一、原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthineH，氨基喋呤AminoopterinA及胸腺嘧啶核苷ThymidineT），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较，见表10-1。表10-1单克隆抗体与常规抗血清的性质比较性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μg/ml多mg/ml无关的Ig多少或几乎无·2·其它血清蛋白有少，培养物上清常有10％胎牛血清Ag-Ab结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。结合到共同决定簇则是完全的免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质典型光谱抗体的单一性质二、动物的选择与免疫（一）动物的选择目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。（二）免疫一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。1．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取·3·脾做融合用。２.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。三、细胞的选择（一）脾细胞1．材料(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。(2)1640培养液(3)2.5％FCS－1640营养液2．操作方法(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。(5)直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。(6)以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。(8)重复⑹、⑺步骤。(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。（二）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO·4·以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数。（三）饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。1．材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。2．操作方法（1）拉颈处死小鼠。（2）70％酒精浸泡消毒10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（5）1000r／min离心10min。（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。·5·四、细胞融合（一）融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。（二）融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。(2)1640培养液100ml。(3)完全1640液100ml。(4)2.5％FCS－1640液50ml。(5)HAT培养液100ml。(6)50％PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。(8)40孔塑料培养盘。2．操作方法⑴准备好脾细胞。⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5·6·％FCS－1640液。⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。⑷移去上清液。⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。⑹加预热至40℃的50％PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。⑻重复⑺一次。⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。⑽重复⑼一次。⑾加1640液15ml。⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。（三）细胞融合的关键1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。五、抗体检测及杂交瘤细胞的选择·7·（一）抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产