第四章高效液相色谱

高效液相色谱法一、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统由两相——固定相和流动相组成。固定相可是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂一层液膜）、离子交换树脂或多孔凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相（或洗脱液）推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小差异进行分离。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱及尺寸排阻色谱等。为了更好地了解HPLC优越性，从两方面进行比较:HPLC比经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高效液相色谱法与气相色谱法（l）气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低化合物，占有机物总数20％。对于占有机物总数近80％的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，主要采用HPLC进行分离和分析（只要试样能制成溶液，不需要气化，因此不受试样挥发性的限制）（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：①气相色谱流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。在液相色谱中，流动相液体与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上液体作流动相，增大分离选择性。②液相色谱固定相类型多，分析时选择余地大。③液相色谱通常在室温下操作。较低的温度，有利于色谱分离条件选择。高效液相色谱仪分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。工作过程：高压泵将贮液瓶中流动相溶剂送入色谱柱。当注入欲分离样品时，流经进样器的流动相将样品带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出信号记录下来，得到液相色谱图。一、高效液相色谱仪主要部件（1）高压输液系统高效液相色谱固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备高压输液系统。高压输液泵应符合:密封性好，输出流量恒定，压力平稳,可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。（2）进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短（约5～30cm），柱外展宽（柱外效应）较突出进样装置:流路中为高压工作状态，使用耐高压六通阀进样装置（3）分离系统—色谱柱色谱柱是液相色谱心脏，包括柱管与固定相。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱填充物和分离柱完全一样，使淋洗溶剂经过前置柱为其中固定相饱和，在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性能不受影响。（4）检测系统连续检测经色谱柱分离后流出物组成和含量变化。目前最常用检测器：紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器示差折光检测器(5)附属系统包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集、数据处理等。梯度洗脱装置是高压液相色谱仪中重要附属装置。梯度洗脱：分离过程中使两种或两种以上不同极性溶剂按一定程序连续改变它们之间比例，使流动相极性、pH值或离子强度相应变化，提高分离效果，缩短分析时间。梯度洗脱实质：不断变化流动相极性、pH值或离子强度，调整混合样品中各组分分配比(容量因子)k，使样品组分在最佳容量因子值范围流出柱子.液相色谱中作用相当于气相色谱中程序升温。不同的是，梯度洗脱中样品组分k值变化是通过改变流动相极性、pH和离子强度实现，不是通过改变温度来达到（气相色谱）。在线脱气装置用于脱去流动相中溶解气体，流动相经脱气装置后再输送到色谱柱。影响流动相分离的因素：流动相流速，性质和极性高效液相色谱固定相和流动相（－）固定相以承受高压能力分类，分为刚性固体和凝胶两类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa高压，制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。凝胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱，由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。（二）流动相及流动相极性（1）显著改变组分分离状况的流动相选择非常重要。又称淋洗液、洗脱剂。（2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相极性小于固定相极性，为正相分配色谱。适于极性化合物分离。流出顺序为：极性小先流出，极性大后流出。（3）若流动相极性大于固定相极性，为反相分配色谱。极性大先流出，极性小后流出。对流动相要求HPLC中流动相是液体，对组分有亲和力，参与固定相对组分竞争。对流动相溶剂要求：（1）溶剂对于待分离样品，必须具有合适极性和良好选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。（3）纯度高。（4）化学稳定性好。（5）低粘度。对于紫外吸收检测器，不能用对紫外光有吸收的溶剂。对于示差折光检测器，要求选择与组分折射率有较大差别溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。HPLC主要分离类型：1.吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等。流动相是不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）：早期在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合固定相，通过化学键将固定液键合在担体表面。3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱水溶液。根据各种离子与树脂上交换基团交换能力不同而得到分离4.凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体。高效液相色谱法主要类型及选择（－）液-液分配色谱法流动相和固定相都是液体，适用于各种类型样品分离和分析，无论是极性和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型和非离子型化合物。原理：原理同液-液萃取。根据物质在两种互不相溶液体中溶解度不同，具有不同分配系数。流动相极性小于固定相极性，称为正相分配色谱，适用于极性化合物分离。流动相极性大于固定相极性，称为反相分配色谱。适用于非极性化合物分离（二）化学键合相色谱采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合相色谱。由于键合固定相稳定，使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适合分离容量因子k值范围宽的样品。键合到载体表面官能团可是各种极性的，适用于种类繁多样品分离1.键合固定相类型制备键合固定相的载体为硅胶。（1）疏水基团如不同链长烷烃（C8和C18）；（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3）离子交换基团2．反相键合相色谱采用极性较小键合固定相，流动相是采用极性较强溶剂。多用于分离多环芳烃等低极性化合物；反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。反相键合相色谱分离机理：被分离物非极性部分与固定相表面疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；被分离物极性部分受到极性流动相作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。两种作用力之差，决定分子在色谱柱中保留行为。3.正相键合相色谱极性有机基团，如CN、NH2、双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；以非极性或极性小溶剂（如烃类）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为流动相，分离极性化合物。三）液-固吸附色谱固体吸附剂为固定相，吸附剂是多孔固体颗粒物质，表面存在吸附中心。根据物质在固定相吸附作用不同进行分离原理：当流动相通过吸附剂时，吸附剂表面活性中心吸附流动相分子。当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度保留就要取代数目相当的已被吸附在固定相中的流动相溶剂分子（S）。在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS试样分子（X）流动相溶剂分子（S）平衡时Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留弱，易于洗脱。(四）离子交换色谱利用离子交换原理和液相色谱技术结合的分离分析方法。在溶液中能够电离的物质，都可用离子交换色谱分离。适于无机离子混合物分离，亦可用于有机物分离，如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。原理：离子交换色谱利用不同待测离子对固定相亲和力差别进行分离。固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。待分离物质电离后产生的离子与树脂上可游离平衡离子进行可逆交换阳离子交换(磺酸型阳离子交换树脂)：nadnadadSXSXK]][[]][[RSO3-H++M+RSO3-M++H+阴离子交换(季铵型阴离子交换树酯)：达平衡时，平衡常数（离子交换反应选择性系数）：[A]r，[B]r代表树脂相中可游离平衡离子（A）和试样离子（B）浓度，[A]、[B]代表溶液中浓度。离子交换反应选择性系数表示试样离子B对A型树脂亲和力大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。（五）尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱又称凝胶色谱，用于较大分子分离。不具有吸附、分配和离子交换机理，基于试样分子尺寸和形状不同来实现分离。分离原理：按分子大小进行分离的一种色谱法。固定相为化学惰性多孔物质——凝胶，类似于分子筛。凝胶内具有一定大小孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中被排阻，较早被淋洗出来；中等体积分子部分渗透；小分子完全渗透其内，最后流出色谱柱。样品分子按分子大小，排阻先后流出色谱柱。特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，能提供分子结构的信息；（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低检测器；（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，柱寿命长；（4）不能分辨分子大小相近化合物，相对分子质量差别必须大于10％。(六)亲和色谱（affinitychromatography）利用生物大分子和固定相表面存在特异性亲和力，进行选择性分离的方法。通常在载体表面先键合一种所谓间隔臂（如环氧、联氨等），再连接上配基（酶、抗原或激素等）。（七）分离类型选择1．根据相对分子质量选择2．根据溶解度选择3．根据分子结构选择超临界流体色谱法超临界流体为流动相在临界温度和临界压力以上，物质以超临界流体状态存在物理性质介于气体和液体之间。RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+Cl-rrABABABK]][[][][/